Notch基因胞內活化部分真核表達載體p3XFLAG-CMV7-NICD1的構建與鑒定

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院眼科，沈陽 110004；2.沈陽市第四人民醫院眼科，沈陽 110031）

Notch基因胞內活化部分真核表達載體p3XFLAG-CMV7-NICD1的構建與鑒定

劉蕾1，2，肖偉1

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院眼科，沈陽 110004；2.沈陽市第四人民醫院眼科，沈陽 110031）

目的構建Notch1基因胞內活化部分真核表達載體p3XFLAG-CMV7-NICD1，為進一步研究和解析Notch1基因在促進人晶狀體上皮細胞間質化過程的作用做準備。方法從SRA01/04細胞中提取總RNA，RT-PCR法反轉錄合成cDNA。特異擴增目的基因片段NICD1，與p3XFLAG-CMV7載體連接后轉化大腸桿菌DH5α，LB平板培養基篩選菌落，抽提質粒。并用酶切，測序，轉染細胞后檢測蛋白表達等方法驗證。結果獲得重組的p3XFLAG-CMV7-NICD1真核表達載體質粒，經雙酶切及測序檢測，NICD1基因插入載體部位正確，堿基序列正確。Western blot結果顯示，在轉染p3XFLAG-CMV7-NICD1的細胞中有NICD1蛋白的表達。結論p3XFLAG-CMV7-NICD1真核表達載體質粒構建成功，為進一步研究Notch1傳導通路與白內障摘除術后發生后囊膜混濁的關系奠定基礎。

Notch1信號通路；NICD1；上皮間質轉化；后囊膜混濁

晶體后囊膜混濁（posterior capsular opacification，PCO）是白內障摘除術后最常見的并發癥，常常導致術后視力下降。前囊膜上殘留的細胞遷移到后囊膜并進行上皮細胞上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是后囊膜混濁發生的關鍵。有研究表明Notch信號傳導通路且能夠促進上皮間質纖維化。當Notch1配體與相鄰細胞的受體結合后即觸發Notch1信號活化，NICD1即為Notch1蛋白的活化形式［1］。本課題從SRA01/04細胞中提取總RNA，經RT-PCR擴增獲得Notch1基因胞內段基因片段（NICD1）構建真核表達質粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1，為進一步研究Notch1傳導通路與白內障摘除術后發生后囊膜混濁的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與細胞

真核表達載體p3XFLAG-CMV-7（購自Sigma公司），SRA01/04細胞（中國醫科大學實驗室保存）及感受態細胞E.coli Competent cells DH5α（購自Takara公司）。

1.2 試劑

RNAprep pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒，普通DNA產物純化試劑盒（購自TIANGEN公司）。Taq DNA Polymerase，dNTPs脫氧核苷酸（購自Takara公司）。質粒DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒（購自AXYGEN公司）。DNA T4連接酶、XbaI/BamHI核酸內切酶（購自NEB公司）。LipofectamineTMLTX轉染試劑（購自Invitrogen公司）。兔抗NICD1多克隆抗體（購自Cell Signaling Technology公司），兔抗Flag多克隆抗體（購自北京博奧森公司）。

1.3 引物設計與合成

參照文獻［2］，并從GenBank獲取Notch1胞內段基因已知序列，根據末端氨基酸序列分析結果，用Primer 5軟件設計出可擴增NICD1相對應堿基在內的引物，并分別在上游及下游引物引入XbaI/Bam-HI酶切位點，上游引物：5C-GCCTCTAGAGTGCTGC TGTCCCGCAAGCGC-3C，下游引物：5C-CGGGATC CTTATTTAAATGCCTCTGGAATGTGGG-3C，引物由TaKaRa公司合成。

1.4 胞內段NICD1目的基因擴增

按TaKaRa公司試劑盒說明書提取SRA01/04細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。以此cDNA為模板，運用以上設計引物，按照程序行PCR擴增：93℃預變性3 min；93℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環35次；72℃延伸10 min。

1.5 p3XFLAG-CMV-7-NICD1重組質粒的構建

XbaI/BamHI同時對目的DNA片段及質粒p3XFLAG-CMV-7進行雙酶切（3 h），瓊脂糖凝膠電泳回收目的DNA酶切片段和p3XFLAG-CMV-7載體酶切片段并定量，建立如下連接反應體系：p3XFLAG-CMV-7載體1 μL，NICD1插入片段1 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，10×連接緩沖液0.5 μL，加重去離子水2 μL，總反應體積5 μL。22℃連接1 h。結束后轉化感受態大腸埃希菌DH5α，涂布于37℃預熱的含氨芐青霉素的LB平板，37℃倒置培養過夜。隨機挑取轉化子接種于LB液體培養基，37℃、220 r/min振搖培養過夜。按AXYGEN質粒DNA提取試劑盒說明書提取質粒DNA。

1.6 p3XFLAG-CMV-7-NICD1重組質粒的鑒定

p3XFLAG-CMV-7-NICD1重組質粒的XbaI/ BamHI雙酶切反應體系：XbaI，1 μL；BamHI，1 μL； 10xNEB Buffer，3 μL，p3XFLAG-CMV-7-NICD1，5 μL；100×BSA，0.3 μL；ddH2O，20.7 μL。37℃3 h。質粒測序由Takara公司完成。

1.7 細胞轉染及Western blot檢測

按照LipofectamineTMLTX說明書進行轉染。實驗組p3XFLAG-CMV-7-NICD1，空載體p3XFLAGCMV-7為對照組分別用LipofectamineTMLTX試劑轉染入SRA01/04細胞中。轉染4 h后換液，24 h后進行Western blot檢測。采用RIPA蛋白提取液制備細胞總蛋白，BCA法蛋白質定量后取40 μg總蛋白進行Immunoblotting檢測帶Flag標簽的NICD1的表達。以兔抗Flag多克隆抗體（1∶1 000）為一抗，辣根酶標記的山羊抗兔IgG（1∶3 000）為二抗，抗體反應結束后加入Pierce公司的增強型ECL化學發光試劑盒顯色。

2 結果

2.1 NICD1基因片段和真核表達載體p3XFLAGCMV-7的制備

真核表達載體p3XFLAG-CMV-7和RT-PCR擴增后的NICD1基因片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1），分別可見約4 700 bp和2 361 bp的特異條帶，條帶分子大小與預計相同。

圖1 p3XFLAG-CMV-7和NICD1片段電泳結果Fig.1 RT-PCR products of p3XFLAG-CMV-7 and NICD1

2.2 酶切鑒定重組表達質粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1

重組質粒用XbaI/BamHI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳（圖2），可見切下大小約為4 700 bp及2 300 bp的2條條帶，分別為p3XFLAG-CMV-7和NICD1。片段大小與預測結果一致。表明NICD1基因已成功克隆至真核表達載體p3XFLAG-CMV-7中。

2.3 重組表達質粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1測序分析

圖2 p3XFLAG-CMV-7-NICD1雙酶切結果Fig.2 Digestion products of p3XFLAG-CMV-7-NICD1 with enzymes

重組質粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1送Takara公司進行測序鑒定（圖3），目的片段與GenBank中人Notch1胞內段基因的序列進行比對，測序結果與GenBank報道的人Notch1胞內段基因序列一致。鑒定結果表明目的片段已正確插入p3XFLAG-CMV-7表達載體。

2.4 真核表達載體p3XFLAG-CMV-7-NICD1在SRA01/04細胞中的表達

通過LipofectamineTMLTX試劑將p3XFLAGCMV-7-NICD1和對照的空載體分別轉染SRA01/04細胞，24 h后提取總蛋白，進行Western blot檢測。結果如圖4顯示，在實驗組中有Flag-NICD1蛋白的表達，分子量大小約120 kDa，而轉染空質粒的細胞未見表達。

圖3 p3XFLAG-CMV-7-NICD1真核表達載體測序結果Fig.3 The gene sequencing results of p3XFLAG-CMV-7-NICD1

圖4 重組蛋白FLAG-NICD1的Western blot檢測結果Fig.4 Expression of FLAG-NICD1 protein analyzed by Western blot

3 討論

后發性白內障指白內障摘出術（囊外摘出、單純吸除或超聲乳化白內障吸除）后，或外傷性白內障部分皮質吸收后殘留晶狀體上皮細胞（lens epkhelial cells，LECs）增生、分化并移行導致的晶狀體后囊膜混濁，簡稱后發障。PCO是白內障術后最常見的影響視力的并發癥［3］。成人白內障術后2年內有20%～30%的患者因PCO而視力下降［4］，ECCE術后5年內仍有43%的患者會發生PCO［5］。而兒童術后早期即會發生嚴重的后發障，且發生率高達100%。

目前研究認為，晶狀體上皮細胞增殖、迀移、上皮間充質轉化、膠原沉積和晶狀體纖維組織形成是PCO的主要原因。白內障手術刺激可能誘導晶狀體發生創傷愈合反應，殘余的LECs增殖并沿后囊膜遷移，經過上皮間充質轉化形成晶狀體纖維組織［6］。與其他組織器官的纖維化機制有所不同，腎間質纖維化和肺纖維化組織中的肌成纖維細胞可由成纖維細胞和上皮細胞轉化形成，而晶狀體組織局部不存在成纖維細胞，晶狀體纖維化過程中肌成纖維細胞只來源于上皮細胞，因此，研究EMT在PCO發生過程中的作用有重要價值［7，8］。誘導EMT的主要分子信號通路有Wnt/p-catenin信號通路、細胞外基質/ ILK信號通路和TGFp/Smad信號通路以及Notch信號通路。1917年，Morgan及其同事在果蠅體內發現一種基因，因其功能部分缺失可導致果蠅翅緣出現缺口，故命名該基因為Notch［9］。

近來有研究表明Notch1在晶狀體上皮細胞中有表達，而且在正常晶狀體組織及再生晶狀體組織中均檢測到Notch1表達［10，11］。Notch1信號激活后，NICD1是Notch1的活化形式，NICD1進入細胞核內發揮傳遞信號的作用。外源性NICD1編碼基因導入靶細胞后，其對靶基因的調控與Notch1配體所誘導的Notch1信號途徑激活一致［12，13］。

本研究通過從SRA01/04細胞中提取總RNA，RT-PCR法反轉錄合成cDNA。進一步擴增獲Notch1胞內段基因片段（NICD1），將其克隆于真核表達載體p3XFLAG-CMV-7，構建真核表達質粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1，酶切鑒定結果與預期一致；測序結果與GenBank報道的人Notch1胞內段基因序列完全一致。Western blot檢測p3XFLAG-CMV -7-NICD1轉染細胞中有NICD1蛋白表達。為進一步研究Notch1信號上調促進EMT和白內障摘除術后發生后囊膜混濁的關系奠定基礎。

［1］De Strooper B，Annaert W，Cupers P，et al.A presenilin-1-dependent gamma-secretase-like protease mediates release of Notch intracellular domain［J］.Nature，1999，398（6727）：518-522.

［2］Ong CT，Cheng HT，Chang LW，et al.Target selectivity of vertebrate notch proteins.Collaboration between discrete domains and CSL-binding site architecture determines activation probability［J］.J Biol Chem，2006，281（8）：5106-5019

［3］Awasthi N，Guo S，Wagner BJ.Posterior capsular opacification：a problem reduced but not yet eradicated［J］.Arch Ophthalmol，2009，127（4）：555-562

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［5］Sundelin K，Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction［J］.J Cataract Refract Surg，1999，25（2）：246-250.

［6］Wormstone IM.Posterior capsule opacification：a cell biological perspective［J］.Exp Eye Res，2002，74（3）：337-347.

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［8］Saika S.Relationship between posterior capsule opacification and intraocular lens biocompatibility［J］.Prog Retin Eye Res，2004，23（3）：283-305.

［9］S jolund J，Manetopoulos C，Stockhausen MT，et al.The Notch pathway in cancer：Differentiation gone awry［J］.Eur J Cancer，2005，41（17）：2620-2629.

［10］Chen X，Ye S，Xiao W，et al.ERK1/2 pathway mediates epithelialmesenchymal transition by crossinteracting with TGFβ/Smad and Jagged/Notch signaling pathways in lens epithelial cells［J］.Int J Mol Med，2014，33（6）：1664-1670.

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［12］Miele L.Notch signaling［J］.Clin Cancer Res，2006，12（4）：1074-1079.

［13］Talora C，Cialfi S，Segatto O，et al.Constitutively active Notch1 induces growth arrest of HPV-positive cervical cancer cells via separate signaling pathways［J］.Exp Cell Res，2005，305（2）：343-354.

（編輯裘孝琦）

Construction and Identification of Recombinant Plasmid ofp3XFLAG-CMV7-NICD1

LIULei1，2，XIAOWei1
（1.DepartmentofOphthalmology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo constructthe eukaryotic expression vectorof Notch1intracellulardomain，p3XFLAG-CMV7-NICD1，so as to prepare for the further research and exploration of effect of Notch1on promoting epithelial-mesenchymal transition of human lens epithelial cells.MethodsThe cDNA fragmentwas reversely transcribed by RT-PCRfrom totalRNA extracted from the SRA01/04 cells and was encoded with the specific amplification-targeted NICD1was obtained from the SRA01/04 cells，then the cDNA fragment was inserted into p3XFLAG-CMV7 to transcribe Escherichia coli DH5α.And the recombinant plasmid was extracted after bacterial screening by LB plating medium and confirmed by the restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.ResultsThe target gene obtained had the same molecular size as predicted.It was indicated that recombined p3XFLAG-CMV7 plasmid contained correct recombinant human Notch1sequences and p3XFLAG-CMV7-NICD1was constructed successfully.The western blotting showed protein NICD1 expressed in SRA01/04 cells transfected with p3XFLAG-CMV7-NICD1.ConclusionThe successful construction of p3XFLAG-CMV7-NICD1will provide a foundation for a further study studies in on the effect relationship of Notch signaling pathway and in posteriorcapsularopacification（PCO）aftercataractextraction.

Notch1 signaling pathway；NICD1；epithlial-mesenchymal transition；posterior capsular opacification

R776.1

A

0258-4646（2015）03-0217-04

劉蕾（1979-），女，主治醫師，博士研究生.

肖偉，E-mail：xiaow@sj-hospital.org

2014-10-30

網絡出版時間：