小鼠Sema3A基因過表達慢病毒載體的構建與鑒定

（1.遼寧省口腔醫學研究所口腔正畸學研究室，中國醫科大學附屬口腔醫院正畸科，沈陽 110002；2.遼寧省口腔醫學研究所口腔頜面外科學研究室，中國醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，沈陽 110002）

小鼠Sema3A基因過表達慢病毒載體的構建與鑒定

閻秀林1，陳鈺文1，金婕1，朱玉1，王健1，張揚1，盧利2

（1.遼寧省口腔醫學研究所口腔正畸學研究室，中國醫科大學附屬口腔醫院正畸科，沈陽 110002；2.遼寧省口腔醫學研究所口腔頜面外科學研究室，中國醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，沈陽 110002）

目的構建小鼠Sema3A基因過表達慢病毒載體。方法通過體外合成小鼠全長Sema3A cDNA，采用Gateway技術將其基因插入到pDown-mSema3A-IRES/EGFP質粒中，再交換重組獲得重組質粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/EGFP，經過測序鑒定后，包裝與濃縮慢病毒載體pLV（Exp）-Puro-CMV-mSema3A-IRES/EGFP，最后重組慢病毒載體轉染293T細胞獲得病毒液。結果重組慢病毒載體11 538 bp，測序結果證實Sema3A基因共2 319 bp正確插入帶有EGFP的載體中，成功構建小鼠Sema3A基因過表達載體。結論成功構建小鼠慢病毒載體pLV（Exp）-Puro-CMV-mSema3A-IRES/EGFP，為該基因在特定細胞內過表達株的篩選奠定基礎。

Sema3A；慢病毒載體

正畸牙移動離不開張力側牙槽骨增生為主和壓力側牙槽骨吸收為主的骨改建過程，而這一過程中如何維持成骨過程與破骨過程的動態平衡的骨穩態十分重要。在骨組織改建的過程中，一些細胞因子和分泌蛋白通過作用于成骨或者破骨的不同環節而具有一定的骨保護功能，如轉化生長因子β［1］、胰島素樣生長因子1［2］、心肌營養素1［3］和干擾素γ［4］等通過促進成骨細胞的遷移與分化或者抑制破骨細胞的生成與分化而發揮骨保護作用。參與免疫和神經元功能調節等多向調節功能的Semaphorin家族的3A（Sema3A）［5，6］在骨改建的過程中從時間上和空間上精確調控成骨細胞和破骨細胞的功能，既能抑制破骨細胞的骨吸收效應又能增加成骨細胞的骨形成效應。Sema3A因其這一獨特的維持骨穩態的功能而倍受矚目［7，8］。

Sema3A是一種分泌蛋白，是第一個被發現的脊椎動物Semaphorin家族蛋白，其對于神經系統的作用已經得到了廣泛而深入的研究［9］。然而近年來，學者們才發現Sema3A還介導免疫調控［10］、心血管內皮的形成［11］、癌癥的發展和骨組織的改建［5，6］等一系列生理和病理過程。Sema3A蛋白通過其特異受體Nrp1在成骨細胞中以及細胞間質中表達，對于其是否在牙周膜、牙骨質和牙本質中表達，目前尚無相關研究。本研究擬構建Sema3A基因過表達慢病毒載體，為研究Sema3A在正畸牙移動骨改建的信號通路中的作用機制提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑：pUp-TRE，PLV/Des2-Neo，PLV/ helPer-SL3，PLV/helPer-SL4，PLV/helPer-SLS，dNTP，Taq酶（廣州賽業）；BP clonaseⅡPlus Enzyme Mix和LR clonaseⅡPlus Enzyme Mix，Stbl3細菌，239T細胞，Lipofectamine2000，無血清OPti-MEM?Ⅰ培養液（Invitrogen）；高糖DMEM，PBS，FBS（Hyclone）；卡那霉素，氯霉素，氨節西林，胰蛋白酶（Gibco）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Qiagen）。

1.1.2 主要儀器：超凈臺，PCR儀，電泳儀與電泳槽，恒溫培養箱，CO2細胞培養箱，倒置相差顯微鏡，高速離心機等。

1.2 方法

1.2.1 attB-mSema3A聚合酶鏈反應產物的獲得：根據Gateway技術要求及pcDNA-mSema3A基因特點，設計帶有attB重組位點的引物（引物由廣州賽業生物科技有限公司合成）。上游引物：attB1 Kozak mSema3A的5′端序列5′-GGTGGCAGCCTGCTTTTT TGTACAAACTTG-3′，下游引物：attB2 mSema3A的3′端反向互補序列5′-ACCCAGCTTTCTTGTACAAA GTGG-3′。PCR反應擴增帶有attB重組位點的mSema3A開放閱讀框架全長序列。純化PCR產物：使用Qiagen瓊脂糖凝膠回收試劑盒對attB-mSema3A的PCR產物進行回收純化。

1.2.2質粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP構建：使用BP反應將兩端帶有attB重組位點的mSema3A插入已有載體的質粒pDown-MCS-IRES/eGFP中，構建質粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP。（1）在室溫中按照以下成分加入到1.5 mL EP管中，包括pDown-MCS-IRES/eGFP質粒，150 ng；attB-mSema3A PCR產物，150 ng；TE緩沖液至8 μL，混勻。（2）冰上溶解Bp clonaseⅡenzyme mix 2 min，短暫漩渦2次。（3）在步驟（1）混勻的反應樣品中加入2 μL Bp clonaseⅡenzyme mix，短暫漩渦混勻2次，短暫離心。（4）25℃孵育2 h。（5）加入1 μL蛋白酶K終止反應，37℃孵育10 min。（6）將BP產物轉化到TOP1O中，分別涂2塊LB平板，一塊含有卡那霉素，另一塊含有卡那霉素和氯霉素。

1.2.3 質粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP的篩選與鑒定：LB瓊脂糖培養基篩選后，選擇陽性單克隆菌落擴大培養，進行PCR鑒定及測序。

1.2.4 重組質粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/ EGFP構建：使用LR clonase將mSema3A-IRES/EGFP交換到目的載體PLV/Des2-puro中，構建慢病毒表達載體pLV（Exp）-puro-mSema3A-IRES/EGFP。（l）在室溫中按照以下成分加入到1.5 mL EP管中，質粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP，5 fmol；pLV.Des3d.P/ Puro，5 fmol；LR clonaseTMⅡPlus Enzyme Mix，1 μL；TE緩沖液補至5 μL，混勻；25℃LR反應16 h。加入蛋白酶K，37℃終止反應10 min。轉化LR反應產物到大腸桿菌Stbl3，從轉化的平板挑取陽性克隆搖菌并小量提取質粒pLV（Exp）-puro-mSema3AIRES/EGFP。酶切，PCR鑒定重組質粒，送交陽性克隆測序。

1.2.5 大提質粒：采用質粒大量抽提試劑盒（德國Qiagen），制備高純度質粒pLV（Exp）-puro-mSema3AIRES/EGFP。

1.2.6慢病毒載體pLV（Exp）-Puro-CMV-mSema3AIRES/EGFP的包裝與濃縮

1.2.6.1 細胞準備 轉染前1 d，接種5×106個293T細胞到12個10 cm培養皿中，放置于37℃、5%CO2培養箱中，培養過夜。轉染當天，從上述培養皿中去除培養液，加入5 mL新鮮的含10%血清DMEM培養液。

1.2.6.2 制備DNA－Lipofectamine2000復合物（以一個10 cm培養皿的用量為標準）取一支無菌的2 mL離心管，加入1.5 mL無血清Opti-MEM?Ⅰ培養液、PLV/helPer-SL3、PLV/helPer-SL4、PLV/helPer-SLS和pLV（Exp）-puro-mSema3A-IRES/EGFP（各3 μg），輕輕顛倒混勻。取另外一支無菌的5 mL離心管，加入1.5 mL無血清Opti-MEM?Ⅰ培養液和36 μL的Lipofectamine2000，輕輕顛倒混勻。室溫孵育5 min。5 min后，將已稀釋DNA加入到含有Lipofectamine2000的無血清Opti-MEM?Ⅰ培養液，輕輕顛倒混勻。室溫孵育20 min。

1.2.6.3 轉染細胞 將DNA－Lipofectamine2000復合物加到293T細胞中，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中過夜。轉染后第1天，更換10 mL新鮮的完全培養液，繼續培養。轉染后48 h，收集病毒液放置4℃，加入新鮮的10 mL培養液繼續培養。收集72 h病毒后，3 000 r/m低速離心，過濾。50 000 g高速離心，沉淀病毒顆粒。加入新鮮培養液溶解病毒顆粒，獲得濃縮病毒液，分裝，-80℃保存。

2 結果

2.1 質粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP陽性克隆的測序與鑒定

質粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP陽性克隆測序由廣州賽業基因技術有限公司完成，測序結果與目標序列完全一致。測序圖見圖1。

圖1 pDown-mSema3A-IRES/EGFP陽性克隆測序圖Fig.1 DNA sequencing chromatogram of positive clone of plasmid pDown-mSema3A-IRES/EGFP

2.2 重組質粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/ EGFP陽性克隆的測序與鑒定

重組質粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/ EGFP陽性克隆測序由廣州賽業基因技術有限公司完成，測序結果與目標序列完全一致。測序圖見圖2。

圖2 pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/EGFP陽性克隆測序圖Fig.2 DNA sequencing chromatogram of positive clone of plasmid pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/EGF

2.3 慢病毒載體圖

慢病毒載體圖見圖3。

2.4 Lenti-CMV-Sema3A-IRES-eGFP-PGK-Puro的包裝

慢病毒包裝前（圖4）、包裝24 h（圖5）和48 h（圖6）的293T細胞。

3 討論

圖3 慢病毒載體圖Fig.3 Lentiviral vector map

圖4 慢病毒包裝前的293T細胞 ×100Fig.4 293T cells before packaging of lentiviral vectors×100

圖5 慢病毒包裝24 h的293T細胞Fig.5 293T cells after 24 h packaging of lentiviral vectors

圖6 慢病毒包裝48 h的293T細胞Fig.6 293T cells after 48 h packaging of lentiviral vectors

正畸牙移動的過程中存在著明顯的骨改建過程，牽張側成骨和壓力側破骨保持著一種動態平衡。通過對于骨改建相關因子的研究可以明確正畸牙移動的分子生物學機制，從而促進正畸牙安全、高效的移動。有學者發現Sema3A-/-小鼠和Nrp1 Sema3A-/-的小鼠均顯示異常的骨和軟骨發育，以及嚴重的骨量喪失的表型。這些研究表明Sema3A-Nrp1復合體在骨改建的過程中具有明確的骨保護作用［5，6］。因此如果能獲得特定細胞Sema3A的過表達株，可以為下一步Sema3A與骨改建關系的體內研究奠定基礎。

本研究選擇目前先進的Gateway技術來構建載體，在不使用限制性內切酶、不進行連接的情況下，大大地簡化了基因克隆的步驟，提高了克隆效率，并且保持目的基因的方向及閱讀框，確保實驗結果的一致性。本實驗未對質粒pDown-mSema3A-IRES/ EGFP行酶切后PCR鑒定，僅僅最后對重組質粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/EGFP進行了一次酶切鑒定加以驗證，節約了實驗成本和時間。

本研究選擇的慢病毒載體區別于一般的逆轉錄病毒，是以HIV-1為基礎發展起來的病毒載體，可以有效的感染分裂期和非分裂細胞，并且感染效率非常高，是傳統方法的數倍甚至數十倍［12］。本研究選擇的基因為小鼠全長mSema3A編號為NM_ 009152.4，共2 319個堿基，慢病毒包裝載體以慢病毒啟動子CMV為載體啟動子，所攜帶的基因mSema3a能夠整合到幾乎所有小鼠細胞基因組中，并且長時間持續穩定表達，同時能夠隨細胞分裂穩定傳遞下去。同時載體內還導入EGFP作為基因整合成功的熒光指示劑，因此成為研究外源基因導入小鼠細胞和小鼠體內的有力工具。

［1］Tang Y，Wu X，Lei W，et al.TGF-β1 induced migration of bone mesenchymal stem cells couples bone resorption with formation［J］.Nat Med，2009，15（7）：757-765.

［2］Canalis E.Growth factor control of bone mass［J］.J Cell Biochem，2009，108（4）：769-777.

［3］Walker EC，McGregor NE，Poulton IJ，et al.Cardiotrophin-1 is an osteoclast-derived stimulus of bone formation required for normal bone remodeling［J］.J Bone Miner Res，2008，23（12）：2025-2032.

［4］Takayanagi H，Ogasawara K，Hida S，et al.T cell-mediated regulation of osteoclastogenesis by signalling cross-talk between RANKL and IFN-γ［J］.Nature，2000，408（6812）：600-605.

［5］Hayashi M，Nakashima T，Taniguchi M，et al.Osteoprotection by semaphorin 3A［J］.Nature，2012，485（7396）：69-74.

［6］Fukuda T，Takeda S，Xu R，et al.Sema3A regulates bone-mass accrual through sensory innervations［J］.Nature，2013，497（7450）：490-493.

［7］Tse MT.Bone diseases：SEMA3A strikes a balance in bone homeostasis［J］.Nat Rev Drug Discov，2012，11（6）：442.

［8］Zaidi M，Iqbal J.Translational medicine：double protection for weakened bones［J］.Nature，2012，485（7396）：47-48.

［9］Kolodkin AL，Matthes DJ，Goodman CS.The semaphorin genes encode a family of transmembrane and secreted growth cone guidance molecules［J］.Cell，1994，75（7）：1389-1399.

［10］Lepelletier Y，Moura IC，Hadj-Slimane R，et al.Immunosuppressive role of semaphorin-3A on T cell proliferation is mediated by inhibition of actin cytoskeleton reorganization［J］.Eur J Immunol，2006，36（7）：1782-1793.

［11］Serini G，Valdembri D，Zanivan S，et al.Class 3 semaphorins control vascular morphogenesis by inhibiting integrin function［J］.Nature，2003，424（6947）：391-397.

［12］陳群，馬守治，郭建斌，等.局部轉染人白細胞介素10基因對去卵巢大鼠實驗性牙周炎牙槽骨吸收的影響研究［J］.中國實用口腔雜志，2012，5（9）：527-532.

（編輯陳姜）

Construction and Identification for Over-expressing LentiviralVectorof mSema3A

YAN Xiu-lin1，CHENYu-wen1，JINJie1，ZHUYu1，WANGJian1，ZHANGYang1，LULi2
（1.DepartmentofOrthodontics，SchoolofStomatology，China MedicalUniversity，Shenyang 110002，China；2.DepartmentofOraland MaxillofacialSurgery，Schoolof Stomatology，China MedicalUniversity，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo construct and identify over-expressing lentiviral vector of mSema3A.MethodsSema3A gene of mice was amplified by PCR，then the gene was inserted into plasmids pDown-mSema3A-IRES/EGFP by Gateway technology.The plasmids pLV/EXPNZ-puro-mSema3AIRES/EGFP were produced by recombination.After sequencing identification，the vector pLV（Exp）-Puro-CMV-mSema3A-IRES/EGFP was packed and condensed.Finally the recombinant vectors were used to transfect 293T cells to obtain virus pools.ResultsThe recombinant lentiviral vectorswere 11 538 bp with EGFP marker，and Sema3A genes were inserted into the lentiviralvectorcorrectly，indicating the over-expressing vector of Sema3A gene in mice was successfully constructed.ConclusionThe over-expressing lentiviral vector of mSema3A was constructed correctly，which lay a foundation ofscreening ofover-expressing strains ofsuch gene in specific cells.

Sema3A；lentiviral vector

R783.5

A

0258-4646（2015）03-0226-05

遼寧省科技廳（2012225015）

閻秀林（1974-），女，副教授，博士.

張揚，E-mail：zhangyangcmu@yahoo.com.cn

2014-12-16

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