雷帕霉素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

（遼寧省腫瘤醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110024）

雷帕霉素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

單廣夷，付成，陳昂，胡濱，畢緩

（遼寧省腫瘤醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110024）

目的探討雷帕霉素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期的影響。方法5637細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理組加入50、100、200和400 nmol/L的雷帕霉素，對(duì)照組不加藥物，每天更換RPMI 1640培養(yǎng)液。MTT法檢測(cè)處理組的生長(zhǎng)抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的雷帕霉素對(duì)5637細(xì)胞增殖周期的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比，雷帕霉素對(duì)5637細(xì)胞有明顯抑制作用，呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。雷帕霉素可以將5637細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖，且未見(jiàn)明顯的凋亡情況。結(jié)論雷帕霉素使5637細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制了膀胱癌5637細(xì)胞的增殖，說(shuō)明雷帕霉素的作用靶點(diǎn)參與了5637的增殖過(guò)程，其有望成為膀胱癌治療的新靶點(diǎn)。

雷帕霉素；5637細(xì)胞；增殖；細(xì)胞周期

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，是全身十大常見(jiàn)腫瘤之一，發(fā)病率排在第9位。膀胱癌主要治療手段為手術(shù)治療，術(shù)后輔助膀胱灌注藥物或靜脈化療，從而降低腫瘤的復(fù)發(fā)率及死亡率。雷帕霉素又名西羅莫司，是一種新型的大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)免疫抑制劑，可用于心臟支架［1］、器官移植［2］、阿爾茲海默癥［3］、保護(hù)心肌［4］、免疫治療［5］、抑制炎癥、抗纖維化［6］、抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)等多個(gè)方面。哺乳動(dòng)

物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是PI3K/Akt/mTOR通路中一種重要的蛋白激酶，是該通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可通過(guò)它來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的調(diào)控。mTOR通路對(duì)細(xì)胞外生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)素、葡萄糖、氨基酸［7］等物質(zhì)的代謝起到重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)多種mTOR抑制劑，如雷帕霉素、替西羅莫司、依維莫司、坦西莫司等。雷帕霉素具有對(duì)mTOR的獨(dú)特抑制作用，因此對(duì)雷帕霉素的深入研究可以為治療膀胱癌找到新方法。雷帕霉素可作用于乳腺癌［8］、肺癌［9］、骨肉瘤［10］、胰腺癌［11］等多種惡性腫瘤。在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，雷帕霉素同樣也是化療藥物的增敏劑。本研究主要探討雷帕霉素對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞系的增殖及細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

雷帕霉素（美國(guó)LC公司）；人膀胱癌細(xì)胞系5637（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；MTT、二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（凱基生物公司）；酶標(biāo)儀（北京普朗醫(yī)療公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代：膀胱癌5637細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。雷帕霉素溶于無(wú)水乙醇，過(guò)濾除菌后-20℃保存，使用時(shí)RPMI 1640稀釋。待接種的細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，空白對(duì)照組不加入雷帕霉素，處理組加入50、100、200和400 nmol/L的雷帕霉素，每天更換培養(yǎng)液。

1.2.2 檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：采用MTT比色法，5637細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種于96孔板，每孔加100 μL含105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液，貼壁培養(yǎng)24 h后，每孔再加入100 μL培養(yǎng)液，使雷帕霉素終濃度為50、100、200和400 nmol/L，每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔并設(shè)對(duì)照孔（加細(xì)胞不加藥物）和凋零孔（加培養(yǎng)液不加細(xì)胞），培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，再培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液。每孔加DMSO 150 μL，避光振蕩混勻，結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)490 nmol的吸光度（optical density，OD）值。按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5637細(xì)胞，6孔板鋪板過(guò)夜，梯度濃度加入雷帕霉素0、50和100 nmol/L，作用48 h后收集1×106個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用預(yù)冷的PBS溶液清洗2次，加入70%冰乙醇5 mL混勻固定，4℃過(guò)夜，離心收集細(xì)胞，PBS再清洗細(xì)胞1次，在離心管中留1 mL PBS，仔細(xì)打散細(xì)胞團(tuán)，加入RNaseA 5 μL（10 mg/mL），37℃溫浴30 min，加入500 μL含50 μg/mL溴化乙錠的PBS，室溫避光30 min，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用x±s表示，計(jì)量資料比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)雷帕霉素抑制5637細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，50 nmol/L的雷帕霉素作用24 h的生長(zhǎng)抑制率為（21.53±0.69）%，400 nmol/L的雷帕霉素作用24 h的生長(zhǎng)抑制率則達(dá)到（26.54±0.65）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。400 nmol/L的雷帕霉素作用72 h的生長(zhǎng)抑制率明顯升高，為（50.61± 0.90）%，是50 nmol/L雷帕霉素作用24 h的生長(zhǎng)抑制率的2倍多。50、100、200和400 nmol/L的雷帕霉素作用5637細(xì)胞24、48、72 h后，隨著藥物濃度和時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)5637細(xì)胞有明顯的抑制效果，呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 雷帕霉素作用5637細(xì)胞后的生長(zhǎng)抑制率比較（%）Tab.1 The inhibition rate of rapamycin on 5637 cell（%）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)雷帕霉素對(duì)5637細(xì)胞周期的影響

雷帕霉素作用5637細(xì)胞48 h后，對(duì)照組、50 nmol/L組和100 nmol/L組G0/G1期細(xì)胞比例呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明雷帕霉素將大量5637細(xì)胞阻滯在了G0/G1期，而S期與G2/M期細(xì)胞比例呈遞減趨勢(shì)，表明處于DNA合成期及合成后期的細(xì)胞減少。5637細(xì)胞的凋亡率未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）。見(jiàn)表2，圖1。

表2 雷帕霉素作用48 h后對(duì)5637細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響（%）Tab.2 The effect of rapamycin on cell cycle of 5637 cells after 48 h（%）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)雷帕霉素作用48 h后對(duì)5637細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響Fig.1 The effect of rapamycin on cell cycle of 5637 cells after 48 h detected by flow cytometry

3 討論

膀胱灌注和靜脈化療是治療膀胱癌的重要手段，但是膀胱灌注和靜脈化療均有不同程度的藥物不良反應(yīng)，給患者的治療信心帶來(lái)影響。而mTOR抑制劑可以通過(guò)信號(hào)通路更準(zhǔn)確的破壞腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)程，毒副作用較低，特異性較強(qiáng)。雷帕霉素最早是以抗生素的形式被發(fā)現(xiàn)，上世紀(jì)90年代中期多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有抗腫瘤作用，如抑制增殖、抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)［10］、調(diào)節(jié)凋亡［11］等。本研究結(jié)果表明，50、100、200和400 nmol/L的雷帕霉素作用5637細(xì)胞24、48和72 h后，隨著雷帕霉素藥物濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。表明雷帕霉素作為mTOR的抑制劑，可以抑制5637細(xì)胞中的mTOR活性，從而說(shuō)明mTOR參與了5637的增殖過(guò)程，是細(xì)胞增殖過(guò)程中的關(guān)鍵因子。因而，探討mTOR抑制劑的作用，可以為膀胱癌治療提供新的治療方案，其有望成為膀胱癌治療的新靶點(diǎn)。

細(xì)胞的增殖是產(chǎn)生新細(xì)胞，代替衰老、死亡和損傷細(xì)胞的過(guò)程。細(xì)胞的增殖即是細(xì)胞分裂的過(guò)程，分為DNA合成前期（G0/G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2/M期）。在腫瘤增殖的過(guò)程中，如果阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)的任一周期，則細(xì)胞增殖的過(guò)程將被阻滯，腫瘤的生長(zhǎng)將被抑制。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，雷帕霉素作用5637細(xì)胞48 h后，對(duì)照組、50 nmol/L組和100 nmol/L組G0/G1期細(xì)胞比例呈遞增趨勢(shì)（P＜0.05），而S期與G2/M期則呈遞減趨勢(shì)（P＜0.05），5637細(xì)胞的凋亡率則未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）。說(shuō)明雷帕霉素將大量5637細(xì)胞阻滯在了G0/G1期，使處于DNA合成期及合成后期的細(xì)胞減少，從而抑制了膀胱癌5637細(xì)胞的增殖，這一過(guò)程與凋亡無(wú)關(guān)。

近年發(fā)現(xiàn)，mTOR具有兩種復(fù)合物，即mTORC1和mTORC2，因此雷帕霉素具體作用還需進(jìn)一步研究。雷帕霉素抑制腫瘤的機(jī)制仍未被完全掌握，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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（編輯陳姜）

EffectofRapamycin on Proliferation and CellCycle of Human Bladder Carcinoma CellLine 5637

SHANGuang-yi，F(xiàn)UCheng，CHENAng，HUBin，BIHuan
（DepartmentofUrology，Liaoning Cancer Hospital&Institute，Shenyang 110024，China）

Objective To evaluate the effect of rapamycin on proliferation and cell cycle of human bladder cancer cell line 5637.MethodsTotally 5637 cellswere maintained in RPMI1640 containing 10%fetalbovine serum，100 U/mLpenicillin and 100μg/mLstreptomycin foradherentculture.Cells were grown at 37℃in a 5%CO2incubator.The 5637 cells were treated with various concentrations of rapamycin solution（50 nmol/L，100 nmol/L，200 nmol/L，and 400 nmol/L）.The control group was daily treated with single RPMI 1640 without medication.The growth repression rate for 5637 cells was evaluated by MTT.Flow cytometry was used to investigate the effect of rapamycin of different concentrations on cell cycle of 5637 cells.ResultsCompared to the control group，rapamycin can inhibit the proliferation of 5637 cells in a concentration and time dependent manner.Rapamycin inhibited 5637 cells at G0/G1thus inhibiting cell proliferation but not inducing apoptosis.ConclusionRapamycin inhibited growth of 5637 bladder carcinoma cells and arrested cell cycle at G0/G1，indicating that mammalian target of rapamycin may play an important role in proliferation of5637 cells and actas a new tumortherapeutic targetin patients with bladdercancer.

rapamycin；5637 cell line；proliferation；cell cycle

R737.14

A

0258-4646（2015）03-0230-04

遼寧省自然科學(xué)基金（20092028）

單廣夷（1982-），男，主治醫(yī)師，博士. E-mail：szlsgy@126.com

2014-12-10

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