加巴噴丁對大鼠坐骨神經慢性壓迫損傷DRG中TRPV1的影響

（大連醫科大學附屬第一醫院 1.麻醉科；2.急診科，大連 116011）

加巴噴丁對大鼠坐骨神經慢性壓迫損傷DRG中TRPV1的影響

閻妮1，欒永1，李潤玖2

（大連醫科大學附屬第一醫院 1.麻醉科；2.急診科，大連 116011）

目的研究加巴噴丁對坐骨神經慢性壓迫損傷（CCI）大鼠DRG中TRPV1的影響。方法使用SD雄性大鼠建立CCI模型，隨機分為3組：對照組，CCI組，CCI+GBP組。使用行為學檢測機械性痛和熱痛。術后第8天，搜集DRG，用RT-PCR和Western blot檢測DRG中TRVP1的表達情況。結果CCI手術后DRG中TRPV1基因的mRNA表達顯著增加，GBP能夠減少CCI后DRG的TRPV1基因的mRNA表達。結論在CCI手術后，DRG中TRPV1基因的表達升高，使用GBP后，其表達降低。

神經痛；加巴噴丁；坐骨神經慢性壓迫損傷；大鼠；TRPV1

神經病理性疼痛（neuropathic pain）是臨床常見的一種慢性疼痛，具有痛覺過敏、痛覺異常和自發性疼痛的特點。神經病理性疼痛的病因比較復雜，包括中樞和外周神經系統的損傷、感染炎癥、異物壓迫、糖尿病等都可能引起患者產生神經病理性疼痛的癥狀。神經病理性疼痛的患者長時間忍受折磨，但由于目前該病的發病機制仍不清楚，沒有合適的治療方法［1］。神經病理性疼痛不單影響患者個人的生活，還會影響到患者的家庭、工作。為此，找到合適的治療藥物緩解疼痛尤其重要。

瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptorpotential vanilloid 1，TRPV1），是指“瞬態感受器電位陽離子通道，子類Ⅴ，成員1”（transient receptor potential cation channel，subfamilyⅤ，member 1），該通道是由TRPV1基因所編碼的蛋白質［2］。該通道被發現存在于中樞神經系統及外周神經系統上，并且涉及痛覺的傳遞和調制，以及整合各種疼痛信息［3］。

目前，加巴噴丁治療神經病理性疼痛的療效逐漸被臨床認可，越來越成為科研的焦點。大量的臨床試驗已證實加巴噴丁可以緩解患者的部分疼痛癥狀［4］，但是內在作用機制仍有待研究。本研究通過坐骨神經慢性壓迫損傷（chronic constriction injury，CCI）大鼠模型，證實加巴噴丁能有效抑制神經病理性疼痛。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康的SD雄性大鼠18只，體質量為190～210 g，購自大連醫科大學實驗動物中心，飼養環境有通風系統，溫度控制在23℃，燈光控制明暗各12 h。 將18只SD大鼠隨機分為3組（每組n= 6）：對照組；手術組，CCI；治療組，CCI+GBP 100 mg/kg加巴噴丁組。

1.2 實驗設備與試劑

Von Frey絲，不銹鋼絲網墊（0.5 cm×0.5 cm），有機玻璃隔板20 cm×10 cm×15 cm，手術器械，戊巴比妥鈉，加巴噴丁。

1.3 大鼠CCI模型

根據Bennet-xie模型制作大鼠CCI模型，腹腔注射麻醉，給大鼠備皮，用75%乙醇消毒，鋪消毒巾，用手術刀在大鼠左側大腿中點切開皮膚，經股二頭肌的縫隙鈍性分離，暴露出坐骨神經，小心將坐骨神經與周圍組織分開。在坐骨神經主干遠端7 mm處，用4號羊腸線將坐骨神經結扎4道，每道之間間隔1 mm。

1.4 行為學檢測

實驗大鼠手術后，觀察其步態和后肢的運動狀態，觀察大鼠是否有肢體癱瘓和運動障礙的問題。

1.4.1 Von-frey檢測大鼠對機械性刺激的反應：測試大鼠行為時，保證環境不受外界干擾，將待檢測大鼠放置在有機玻璃擋板中，下面放不銹鋼網。大鼠適應環境1 h后，使用Von-frey絲扎大鼠左、右足底，每只大鼠刺激3次，每次間隔20 s。大鼠出現抬足、縮足、甩足、舔足等反應。將3次結果取平均值作為機械縮足反射閾值（mechanical withdrwal threshold，MWT）。各組大鼠在手術前測定左足基礎機械痛域，手術后第4天開始，每天測量機械性痛域，測定時間固定為上午10時到11時。

1.4.2 檢測大鼠對熱刺激的反應：在安靜的環境，將熱板測痛儀預熱到55℃，然后將大鼠放置于觀察箱中，檢測大鼠從后足接觸熱板到縮足反射的潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。檢測3次，取平均值，作為熱痛過敏的閾值，最高閾值設定為20 s，超過20 s后正常大鼠可以引起疼痛反應。

1.5 RT-PCR檢測大鼠DRG中TRPV1的mRNA水平

選取CCI手術后第8天處死大鼠，搜集腰3，腰4，腰5的手術側DRG，應用RT-PCR的方法研究GBP對疼痛相關基因TRPV1的影響。使用Primer Premier5.0軟件設計引物，大連Takara公司合成。TRPV1 Forward：5′-GGTGGACGAGGTAAACTGGA-3′，Reverse 5′-GCTGGGTGGCATGTCTATCT-3′，131 bp；GAPDH，Forward：5′-CCGAGGGCCCACTAA AGG-3′，Reverse：5′-GCTGTTGAAGTCACAGGAGA CAA-3′，120 bp。逆轉錄和PCR反應嚴格按照試劑盒操作進行。逆轉錄具體操作：1 μL樣品RNA，1 μ L隨機引物Random Hexamer（50 pmol/μL），2 μL 5× Reverse transcriptase buffer，6 μL RNase-free H2O，在65℃變性5 min后迅速置于冰浴中。再加入2 μL 5×Reverse transcriptase buffer，4 μ L dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL RNase抑制劑（200 U/μL），2 μL DTT（100 mmol/L），1 μL M-MLV Reverse Transcriptase（50 U/μL），總體積為20 μL，于37℃溫育1 h，反應結束后在95℃加熱5 min以滅活逆轉錄酶，4℃冷卻，產物于-20℃保存備用。

實時定量PCR反應體系：sybr green PCR master mix（Applied Biosystems by life technologies）12.5 μL、正義與反義PCR引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL、模板mRNA2 μL。反應條件：95℃10 s，95℃5 s，60℃45 s，共40個循環，反應結束后，自動計算定量結果。

1.6 統計學分析

用SPSS 13.0統計軟件進行分析，實驗結果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 疼痛行為學結果

CCI組與CCI+GBP組大鼠術后健康狀態好，能夠正常飲食，喝水，大鼠體質量沒有明顯降低，手術傷口愈合良好，無感染。這2組大鼠手術后第3天基本恢復正常。術后1周，大鼠手術側下肢長時間懸空或不敢觸地負重，步態表現為跛行，站立時以對側正常后肢負重為主，無肢體癱瘓。

2.2 CCI大鼠機械性刺激痛閾的變化及GBP對其變化的影響

各組手術前左、右后足機械性痛閾無統計學顯著性差異（P＞0.05）。CCI組自術后第4天開始出現患側機械性痛閾顯著下降，與對照組對應時間點相比有顯著性差異（P＜0.01）。CCI+GBP組在手術后4～8 d，出現機械性痛閾上升，與CCI組相比較有顯著性差異（P＜0.01），手術后第10天，其機械性痛閾與CCI組相比較沒有顯著性差異（P＞0.05）。見表1、2，圖1。

2.3大鼠DRG中TRPV1mRNA表達情況

CCI手術后，CCI組與對照組相比較，DRG中TRPV1的mRNA表達升高，有統計學差異（P＜0.05）；CCI+GBP組與CCI組比較，DRG中TRPV1的mRNA表達降低，有統計學差異（P＜0.05）。見圖2。

表1 大鼠CCI手術側后足機械性痛閾的變化（g）Tab.1 Changes of MWT of hind paw of rats at operation side after CCI（g）

表2 大鼠CCI非手術側后足機械性痛閾（MWT）的變化（g）Tab.2 Changes of MWT of hind paw of rats at non-operation side after CCI（g）

圖1 大鼠CCI手術側后足機械性痛閾的變化Fig.1 Changes of MWT of hind paw of rats at operation side after CCI

圖2 大鼠DRG中TRPV1mRNA表達的變化Fig.2 Changes of TRPV1mRNA expression in DRG of rats

2.4 大鼠DRG中TRPV1的蛋白表達情況

CCI手術后，CCI組與對照組相比較，DRG中 TRPV1的蛋白表達升高，有統計學差異（P＜0.05）；CCI+GBP組與CCI組比較，DRG中TRPV1的蛋白表達降低，有統計學差異（P＜0.05）。見圖3。

圖3 大鼠DRG中TRPV1的蛋白表達變化Fig.3 Changes of TRPV1 protein expression in DRG of rats

3 討論

TRPV1受體在外周神經中，主要分布于脊髓背根神經節和三叉神經節中的初級感覺神經元，特別是中小型神經元。TRPV1通道與配體結合后激活膜離子通道，引起鈣離子跨膜流動，使細胞內鈣離子濃度改變，激活一系列細胞內信號，參與多種細胞內病理生理過程。神經損傷后，會產生炎性因子，進而激活TRPV1受體。有研究證明TRPV1受體與神經病理性疼痛的形成相關。朱琳等［5］的研究發現，TRPV1受體被辣椒素激活后，會產生神經興奮，隨后導致TRPV1受體發生脫敏反應。在臨床應用當中，8%濃度的辣椒素透皮貼劑可以緩解帶狀皰疹后的神經疼痛［6］。TRPV1受體被激活還會引起降鈣素基因相關肽的釋放，從而導致血管擴張和血漿外滲，這也是產生神經性炎癥的重要原因［7］。使用辣椒素可以緩解弗氏佐劑引起的炎癥痛［8］。近期有報道，辣椒辣素坐骨神經周圍給藥可以減輕神經松弛結扎所引起的痛覺過敏［9］。許先成等［10］研究發現，在糖尿病大鼠神經病理性疼痛的模型中，大鼠背根神經節中TRPV1的表達增高與疼痛的形成和維持有關。最近的一份研究報道證實，TRPV敲除的小鼠，由外周神經損傷引起的機械痛敏比野生型小鼠輕，并且其機制與脊髓背角中間神經元的抑制信號的減弱有關，為TRPV在神經病理性疼痛中的作用提供了更為直接的證據［11］。本研究通過構建大鼠CCI的動物模型，研究加巴噴丁對DRG中TRPV1的變化情況。

通過行為學實驗，證明大鼠CCI模型建立成功，并且在CCI模型的大鼠注射加巴噴丁，可以改善大鼠的疼痛程度。利用RT-PCR技術檢測DRG中TRPV1的基因表達，結果發現CCI手術后TRPV1表達明顯升高，注射加巴噴丁后，能夠降低由CCI手術引起的TRPV1表達增高的情況。利用Western blot技術檢測DRG中TRPV1的蛋白表達情況，結果表明與mRNA水平的表達一致，CCI后TRPV1蛋白表達增高，加巴噴丁能夠降低CCI手術引起的TRPV1蛋白表達增高。

外周神經損傷引起的神經病理性疼痛，表現為痛覺過敏、異常痛敏、感覺缺失和自發性疼痛。外周神經損傷后會有離子通道表達的改變，這種改變可能是受損傷神經纖維興奮性增高和放電的重要原因。有文獻報道，結扎周圍神經可以引起神經源性的疼痛，從而導致DRG中TRPV1的表達增加［12］。

通過我們的研究發現，加巴噴丁能夠緩解CCI的行為學表現，并降低TRPV1在基因與蛋白水平的表達，提示我們，加巴噴丁有可能通過TRPV1通道發揮緩解疼痛的作用。TRPV1有可能是加巴噴丁的作用位點。

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［5］朱琳，章鵬宇，王景杰，等.小膠質細胞在腸易激綜合征IBS內臟高敏感化作用的展望［J］.山西醫科大學學報，2011，42（5）：434-437.

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（編輯裘孝琦）

The Effectof Gabapentin on TRPV1 in RatDRGafter CCI

YAN Ni1，LUANYong1，LIRun-jiu2
（1.Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China；2.Emergency Department，The First Affiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo study the effect of Gabapentin（GBP）on the transient receptor potential vanilloid l（TRPV1）in dorsal root ganglion（DRG）of rats with chronic constriction injury（CCI）.MethodsSD male rats were used to establish CCI model and randomly divided into 3 groups，the controlgroup，the CCIgroup，and the CCI+GBPgroup.Mechanicalallodynia and thermalhyperalgesia were measured to evaluate the establishment of CCI model and the analgesic effect of GBP.At the postoperative 8 days，all rats were sacrificed and dorsal root ganglions were collected for further RT-PCR and Western-blotting analysis to detect expression of TRVP1 in DRG.ResultsThe mRNA and protein expression of TRPV1 were both significantly increased in DRG after CCI operation and GBP could decrease mRNA expression of TRPV1 gene in DRG after CCI.ConclusionThe expression ofTRPV1 was increased in DRGafter CCIoperation which wasdecreased afteradministration ofGBP.

neuralgia；Gabapentin；chronic constriction injury；rat；TRPV1

R745.4

A

0258-4646（2015）03-0234-04

遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2013351）

閻妮（1978-），女，主治醫師，碩士研究生.

李潤玖，E-mail：jizhenicu@163.com

2014-11-30

網絡出版時間：