內毒素耐受對細胞因子的影響

（中國醫科大學附屬第四醫院風濕免疫科，沈陽 110032）

內毒素耐受對細胞因子的影響

趙欣欣，閔睿，張麗麗

（中國醫科大學附屬第四醫院風濕免疫科，沈陽 110032）

目的進一步明確內毒素耐受時炎性相關細胞因子的變化。方法昆明鼠分組處置。建立內毒素（LPS）耐受鼠模型。ELISA方法測定血清腫瘤壞死因子α（TNF-α），白細胞介素10（IL-10）和白細胞介素17（IL-17）濃度。結果LPS對照組血清TNF-α、IL-10和IL-17濃度分別為（2 261.49±1 090.28）pg/mL，（7 780.42±2 320.04）pg/mL，（27.28±13.76）pg/mL，較健康對照組顯著增高。而內毒素耐受組相應細胞因子血清濃度分別為（1 174.19±450.91）pg/mL，（1 293.26±520.85）pg/mL，（22.26±11.44）pg/mL。地塞米松干預進一步降低了TNF-α和IL-17的水平，但對IL-10水平無顯著影響。結論內毒素耐受狀態與內毒素炎癥狀態比較，TNF-α和IL-10水平顯著降低，IL-17水平無顯著變化。應用地塞米松可進一步降低內毒素耐受狀態下的TNF-α和IL-17水平。

內毒素耐受；腫瘤壞死因子α；白細胞介素10；白細胞介素17

內毒素也稱為脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌菌壁的主要成分，在人體內LPS通過作用于Toll樣受體4激活核因子κB，使機體產生顯著的炎性反應，多種促炎細胞因子升高，如腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-8、干擾素等，同時還伴隨多種抗炎介質，如IL-10、轉化生長因子β、糖皮質激素的升高，嚴重時可出現系統性炎性反應綜合征、多器官功能障礙綜合征而危及生命。然而，如預先予機體小劑量的LPS刺激，機體對隨后大劑量或致死量LPS刺激呈現出低反應甚至無反應的現象，這種現象稱為內毒素耐受。內毒素耐受的形成避免了機體產生持續過度的炎性反應，對機體是一種保護作用。內毒素耐受的發生機制尚未完全清楚。目前認為LPS主要作用于單核/巨噬細胞，誘發炎性反應或內毒素耐受均主要通過單核/巨噬細胞系統產生，標志性事件是炎癥時TNF-α水平顯著升高，而內毒素耐受時TNF-α升高水平顯著下降［1］。IL-17也是重要的促炎因子，在慢性炎癥和自身免疫性炎癥中發揮重要作用。內毒素耐受時，炎癥表現明顯受抑，是否也影響IL-17的產生值得研究。到目前為止，尚未見相關研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：8～12周齡雌性昆明小鼠，體質量26～38 g，購于中國醫科大學實驗動物中心，SPF級，飼養于中國醫科大學附屬第四醫院動物室獨立通風籠具系統，標準滅菌復合飼料及純凈水飼養，室內自然溫度及光照。主要試劑：脂多糖（O55：B5）購于寶信生物公司；TNF-α酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒和IL-17 ELISA試劑盒均購于博士德公司。

1.2 昆明小鼠分組

Ⅰ組：健康對照組（10只）；Ⅱ組：LPS陽性對照組（10只）；Ⅲ組：內毒素耐受組（6只）；Ⅳ組：高劑量地塞米松干預內毒素耐受組（6只）；Ⅴ組：低劑量地塞米松干預內毒素耐受組（6只）。

1.3 分組處置

Ⅰ組小鼠連續5 d腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（0.5 mL/d）。Ⅱ組小鼠連續4 d腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（0.5 mL/d），第5天腹腔注射大劑量LPS（8 mg/kg）。Ⅲ組小鼠連續4 d腹腔注射小劑量LPS（80 μg/kg·d），第5天腹腔注射大劑量LPS（8 mg/ kg）。Ⅳ組小鼠連續4 d腹腔注射小劑量LPS（80 μg/ kg·d），第5天腹腔注射大劑量LPS（8 mg/kg），注射大劑量LPS前1 h腹腔注射地塞米松（10 mg/kg）。Ⅴ組小鼠連續4 d腹腔注射小劑量LPS（80 μg/kg· d），第5天腹腔注射大劑量LPS（8 mg/kg），注射大劑量LPS前1 h腹腔注射地塞米松（1 mg/kg）。各組于第5天注射大劑量LPS 3 h后，采用摘眼球法取血標本，留取血清，4℃保存，次日檢測血清細胞因子。

1.4 細胞因子水平測定

取血清標本，依照ELISA試劑盒內說明具體操作，檢測OD值，應用curve exert1.3軟件求得TNF-α、IL-10和IL-17濃度值。

1.5 統計學分析

正態分布數據2組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態分布數據2組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。應用GraphPad6繪制散點圖。

2 結果

血清TNF-α水平（圖1）：健康對照組（Ⅰ組）血清TNF-α濃度處于非常低的水平，LPS陽性對照組（Ⅱ組）TNF-α水平呈爆發式升高，2組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。內毒素耐受組（Ⅲ組）較Ⅱ組TNF-α水平顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），證明內毒素耐受誘導成功，但其水平仍高于Ⅰ組。地塞米松干預內毒素耐受組（Ⅳ組和Ⅴ組）TNF-α水平低于Ⅲ組TNF-α水平，差異有統計學意義（P＜0.01和P＜0.05）。

圖1 各組血清TNF-α水平Fig.1 Serum TNF-α levels in different groups

血清IL-10水平（圖2）：Ⅰ組血清IL-10濃度處于非常低的水平，Ⅱ組IL-10水平亦呈爆發式升高，兩組比較P＜0.01，差異有統計學意義。Ⅲ組較Ⅱ組IL-10水平顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。Ⅳ組IL-10水平較Ⅲ組IL-10水平增高，差異無統計學意義，Ⅴ組IL-10水平較Ⅲ組IL-10水平降低，差異不具有統計學意義。

圖2 各組血清IL-10水平Fig.2 Serum IL-10 levels in different groups

血清IL-17水平（圖3）：Ⅰ組血清IL-17濃度處于較低的水平，Ⅱ組IL-17水平較Ⅰ組增高，差異有統計學意義（P＜0.01），但IL-17水平升高幅度（不足3倍）不如TNF-α和IL-10水平升高的幅度。Ⅲ組IL-17水平較Ⅱ組僅輕度下降，差異無統計學意義。Ⅳ、Ⅴ組與Ⅲ組比較，IL-17水平均下降，差異有統計學意義（P均＜0.01）。

3 討論

圖3 各組血清IL-17水平Fig.3 Serum IL-17 levels in different groups

機體初次受到中小劑量LPS刺激時TNF-α水平顯著升高，形成內毒素耐受時TNF-α升高幅度明顯降低，TNF-α的這種變化特點被認為是形成內毒素耐受的標志。本實驗同樣證實了，當小鼠單次受到LPS刺激時TNF-α水平顯著升高，多次小劑量LPS刺激后，當小鼠受到大劑量LPS刺激后TNF-α升高幅度明顯下降。許多研究表明內毒素耐受的主要環節是單個核細胞的功能發生了顯著的變化［1］，有研究者稱其為“重程序化（reprogramming）”［2］。而TNF-α主要是由活化的單個核細胞產生的。因而內毒素耐受表明單個核細胞系統的致炎功能被抑制。LPS可誘導體外培養的外周血單個核細胞產生內毒素耐受，進一步印證了上述觀點［3］。

IL-10是一種多效性免疫調節細胞因子，具有保護機體免于感染相關性免疫病理損傷的作用，固有免疫和獲得性免疫中的大部分細胞能夠表達IL-10。IL-10缺乏鼠表現出的針對抗原的免疫反應程度加重且反應時間延長，機體出現過度的炎性反應。IL-10缺乏鼠針對LPS的發熱反應也表現為程度加重和時間延長。依賴于IL-10的負反饋在防止由于T細胞介導的自身免疫病和感染誘發的免疫病理性組織損害中具有重要作用［4］。本實驗中，LPS陽性對照組小鼠在單次大劑量LPS刺激后，在TNF-α顯著升高的同時也伴隨IL-10的顯著升高，說明LPS誘發炎性反應的同時也開啟了炎癥的負反饋機制。但在內毒素耐受狀態下，IL-10也隨TNF-α水平降低而降低。小鼠內毒素耐受對細胞因子影響的研究結果表明TNF-α、IL-6和IL-10的產生在免疫耐受狀態下均受到抑制，與本實驗結果相近［5］。體外單個核細胞培養誘導的內毒素耐受也同樣表現為TNF-α和IL-10水平降低［3］。說明IL-10對炎癥的負反饋機制并不是內毒素耐受的產生機制。IL-10基因敲除鼠仍能發生內毒素耐受更加有力的說明IL-10不是內毒素耐受產生的責任細胞因子［6］。

無論體內實驗還是體外實驗都表明LPS誘導的炎性反應不僅引起TNF-α水平的升高，還可引起IL-17水平的升高。IL-17參與許多慢性炎性反應的發生，也與自身免疫狀態具有很強的關聯性［7］。本實驗中，內毒素耐受在降低了以TNF-α促炎因子為代表的炎性反應的同時，也降低了以IL-10為代表的抑炎因子的負反饋反應，但對IL-17水平無顯著影響。Rachmawati等［8］在模擬的內毒素耐受實驗中，以一種抗TLR4單克隆抗體預刺激TLR4，產生了LPS耐受的現象，單核/巨噬細胞的功能受到抑制，但輔助性CD4+T細胞的活性并未受損。Th17細胞也來源于輔助性CD4+T細胞，故此推測其產生IL-17的能力也未受損。這可能是本實驗中內毒素耐受未對IL-17水平產生顯著影響的機制。

糖皮質激素具有抑制IL-17的作用［9］，但在內毒素耐受過程中，這一作用是否受到影響，尚未見報道。本實驗中，對地塞米松干預內毒素耐受組，預先應用糖皮質激素-地塞米松后再使用大劑量LPS注射，則TNF-α和IL-17水平較未用地塞米松的內毒素耐受組顯著下降，提示內毒素耐受狀態下的免疫細胞仍具有對糖皮質激素的反應能力。糖皮質激素可能與內毒素耐受具有協同抑炎作用，能更廣泛的抑制炎性反應，既能抑制固有免疫功能，又能抑制TH17細胞的功能。

內毒素耐受對IL-17是否存在影響，尚未見相關研究報道。本研究初步表明內毒素耐受對IL-17水平無顯著影響，但預先給予地塞米松作用后，內毒素耐受小鼠的IL-17產生受到顯著抑制。

綜上所述，內毒素耐受狀態與內毒素炎癥狀態比較，TNF-α和IL-10水平顯著降低，IL-17水平無顯著變化。應用地塞米松可進一步降低內毒素耐受狀態下的TNF-α和IL-17水平，但對IL-10水平無進一步的顯著影響。這一結果進一步說明了內毒素耐受主要發生在炎性反應的單核/巨噬細胞環節，而對淋巴細胞參與的以IL-17為標志的炎性反應環節影響不顯著。

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（編輯裘孝琦）

EffectofEndotoxin Tolerance on Cytokine

ZHAOXin-xin，MINRui，ZHANGLi-li
（DepartmentofRheumatology，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo further determine the inflammation-associated cytokine changes during endotoxin（LPS）tolerance.MethodsKunming mice were divided into groups.The endotoxin tolerance mouse model was established with repeated injection of LPS.Serum levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-10（IL-10）and IL-17 were determined by ELISA assay.ResultsThe serum concentrations of TNF-α，IL-10 and IL-17 were 2 261.49±1 090.28 pg/mL，7 780.42±2 320.04 pg/mL，and 27.28±13.76 pg/mL in the LPS control group，which were increased significantly compared to the normal healthy control group.The serum concentrations of TNF-α，IL-10 and IL-17 were 1 174.19±450.91 pg/mL，1 293.26±520.85 pg/mL，and 22.26±11.44 pg/mL in the endotoxin tolerance group.Levels ofTNF-αand IL-17 were furtherdecreased by dexamethasone treatment during LPS tolerance inducing，while the IL-10 level did not change significantly.ConclusionCompared to the status of endotoxin inflammation，levels ofTNF-αand IL-10 decreased significantly，while levels ofIL-17 were notsignificantly changed in the status ofendotoxin tolerance.Dexamethasone could furthersuppress TNF-αand IL-17 levels during endotoxin tolerance inducing.

endotoxin tolerance；tumor necrosis factor-α；interleukin-10；interleukin-17

R392

A

0258-4646（2015）03-0259-04

趙欣欣（1968-）男，副主任醫師，博士. E-mail：cellcept@sohu.com

2014-09-18

網絡出版時間：