半夏提取物對小鼠肺水通道蛋白5表達的影響

周建龍，鄧青南，梁 靜（廣州軍區廣州總醫院，廣州510010）

半夏提取物對小鼠肺水通道蛋白5表達的影響

周建龍，鄧青南，梁 靜
（廣州軍區廣州總醫院，廣州510010）

目的 了解急性肺損傷（ALI）小鼠肺組織中水通道蛋白5（AQP5）的表達變化，探討半夏提取物（EP）治療ALI的藥理機制，為半夏的臨床應用提供理論基礎。方法 36只昆明種小鼠隨機分成3組，即空白對照組（NS組）、肺損傷造模組（ALI組）和半夏提取物治療組（EP組），6 h后觀察測定肺組織濕干重比值（W/D），HE染色光鏡下觀察肺炎癥變化，ELISA法檢測小鼠血清TNF-α濃度，RT-PCR檢測肺組織勻漿AQP5 mRNA表達情況。結果 ALI組小鼠肺部炎癥反應顯著，中性粒細胞浸潤為主，同時肺泡明顯充血水腫。EP組肺組織炎癥減輕、充血消退。與NS組和EP組比較，ALI組的W/D值差異有統計學意義（P＜0.05）；ALI組肺組織AQP5 mRNA的表達，較NS組顯著降低，較EP組的表達顯著升高（P＜0.05）。ALI組血清TNF-α的表達，較NS組顯著升高，較EP組的表達顯著降低（P＜0.05）。結論 半夏提取物可通過上調肺AQP5的表達減輕肺水腫，作用機制可能是通過抑制炎癥因子TNF-α的表達實現的。

肺損傷；半夏提取物；水通道蛋白5；小鼠

急性肺損傷是呼吸系統常見重癥，致殘率和病死率高，目前研究［1］發現水通道蛋白（AQP），尤其是AQP5在維持肺泡內外穩態平衡起到關鍵作用。中醫中藥對急性肺損傷有明顯的治療效果［2-3］，半夏提取物或復方半夏湯劑均發現可調節AQP在肺組織內的表達［4］，但半夏能否通過調節AQP來減輕或治療急性肺損傷目前尚無研究。本實驗通過觀察半夏提取物對急性肺損傷的干預，為中藥治療肺損傷提供理論基礎。

1 實驗材料

1.1 動物、試劑與儀器 36只8周齡雄性健康昆明種小鼠（廣東省動物實驗中心，合格證號：4407209314），體質量18～20 g。RNA提取及逆轉錄試劑盒（美國Promega公司）；脂多糖內毒素LPS（美國Sigma公司）；AQP5（上海生工公司）；腫瘤壞死因子αEL ISA試劑盒（武漢博士德公司）；半夏（廣州軍區廣州總醫院）。

1.2 半夏提取物制備 用水煎醇提法取0.5 kg法半夏，先用水煎煮2～3次，取濃縮濾液，再用95％乙醇反復過濾濃縮，制成50 mL半夏提取物，即每1 mL提取物溶液含10 g生藥量。

1.3 急性肺損傷小鼠模型制備 將36只小鼠隨機平均分為3組，分別為空白對照組（NS組）、肺損傷造模組（ALI組）、半夏提取物治療組（EP組）。ALI組和EP組急性肺損傷小鼠模型制備參考文獻［5］的制備方法，給予腹腔注射濃度為 200μg/mL的 LPS （10mg/Kg），空白對照組腹腔注射等量的生理鹽水。EP組小鼠在造模前1周，每天以半夏提取物1.5 mL胃管灌服，1次/d，連用7 d。在造模后6 h時間點處死小鼠，立即解剖小鼠肺組織，左上肺進行濕重/干重比檢測，左中下制作病理切片，行HE檢查。右肺制成肺組織勻漿，采用PCR檢測AQP5，同時取血清檢測TNF-α濃度。

2 實驗方法

2.1 肺濕重/干重比（W/D）的測定 取左上肺稱濕重后，置70℃恒溫箱，24 h后稱干重，計算W/D比值。

2.2 肺組織HE染色片制備和觀察 左中下肺組織經過10％的甲醛固定，石蠟包埋，常規切片，HE染色，光鏡下觀察急性肺損傷的病理變化。

2.3 EL ISA法檢測小鼠中血清的TNF-α 回收的小鼠血液離心后取上清，采用酶聯免疫法（ELISA）檢測，嚴格按照試劑盒測定步驟說明進行。

2.4 肺組織AQP5 mRNA的表達檢測 引物序列分別為：AQP5上游引物：GCGCTCAGCAACAACACAAC，AQP5下游引物：GTGTGACCGACAAGCCAATG，片段長度為 149bp；β-actin上游引物：CTGTCCCTGTATGCCTCTG，下游引物：ATGTCACGCACGATTTCC，片段長度為218bp；AQP5的PCR擴增條件：94℃變性55 s，53.5℃退火55 s，72℃延伸55 s，循環35次，72℃擴增5 min，β-actin的退火溫度為53.5℃，其余條件相同。長波紫外燈下觀察并照相，BioRad成像系統分析電泳條帶，QuantityOne圖像分析軟件計算 AQP5 的mRNA與β-actinmRNA比值。

3 結果

3.1 肺組織肉眼觀察 空白對照組及半夏提取物治療組肺組織外觀均無明顯異常改變。肺損傷模型組肺體積增大，暗紅色，表面可見大小不一散在紅色斑點，切片疏松，可見淡紅色液體滲出。

3.2 肺組織光鏡觀察 空白對照組及半夏提取物治療組光鏡下示肺泡結構基本完整，無明顯異常。肺損傷模型組光鏡下肺泡壁明顯充血增厚，肺泡間隔增寬，腔內可見少許出血滲出、炎性細胞浸潤，肺間質可見充血水腫，大量炎性細胞明顯浸潤（見圖1）。

圖1 HE染色結果

3.3 肺W/D比值 肺損傷模型組的肺W/D比值較對照組顯著升高（P＜0.05），半夏提取物治療組較肺損傷模型組（ALI）明顯改善（P＜0.05），見表1。

表1 各組W/D比值的比較（±s，n＝12）

表1 各組W/D比值的比較（±s，n＝12）

注：與ALI組比較，＃P＜0.05

組別 W/D 比值NS組 4.508±0.217＃ALI組 6.337±0.491 EP組 5.370±0.984＃

3.4 RT-PCR檢測小鼠AQP5mRNA的表達 見圖2。

圖2 PCR電泳結果

3.5 EL ISA檢測小鼠血清TNF-α的表達 EL ISA結果顯示，小鼠血清中TNF-α表達水平在模型組高于空白對照組（P＜0.05）；半夏提取物治療組較模型組降低差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組AQP5mRNA的表達和血清TNF-α濃度的比較（±s，n＝12）

表2 各組AQP5mRNA的表達和血清TNF-α濃度的比較（±s，n＝12）

注：與ALI組比較，＃P＜0.05

組 別 AQP5mRNA TNF-α/（pg/mL）NS組 0.715±0.097＃ 264.37±21.38＃ALI組 0.450±0.081 735.13±28.17 EP組 0.583±0.074＃ 407.23±23.03＃

4 討論

目前，研究表明肺水腫時肺臟的液體平衡破壞及通透性增高，與水通道蛋白（AQPs）密切相關。AQP5表達在氣道分泌上皮頂質膜和肺泡Ⅰ型上皮細胞，主要的生理作用是清除肺泡腔內水分。AQP5特異性地轉運水分子，其他溶質和分子則不能通過，保持血管與間質之間水平衡起到主要作用。內毒素刺激下大鼠肺組織AQP5表達水平明顯下調，肺損傷嚴重，提示機體清除肺間質和肺泡腔過多水分的能力明顯下降，肺泡-毛細血管膜水通透性顯著降低［6］。

半夏是呼吸系統疾病的常用藥［7-8］，其調節氣道黏液分泌、減少肺部液體有獨特的優勢［9］，半夏提取物或復方半夏湯劑均發現可以調節AQP在肺組織內的表達，同時發現半夏可明顯下調肺部炎癥因子TNF-α等的表達［10］，但半夏是否能通過調節AQP來減輕或治療急性肺損傷，目前尚不得知。

本研究發現肺損傷模型組小鼠W/D值較空白對照組明顯增大，同時肺間質水腫AQP5表達明顯下調，提示肺損傷造模成功。經半夏提取物預先治療后，小鼠肺水腫明顯改善，同時AQP5表達上調。炎癥因子TNF-α的表達與AQP5表達結果正好相反，研究表明小鼠肺組織水分吸收障礙可能與AQP5表達下調相關。半夏提取物可通過提高AQP5的表達，提高肺間質水分的跨內皮轉運，使水分子從肺間質回流到肺血管，加快肺泡水分的吸收，達到治療急性肺損傷的目的。研究還發現半夏提取物在上調AQP5表達的同時，可明顯下調血清TNF-α的表達。提示半夏提取物可能是通過抑制炎癥介質釋放如TNF-α，進而在基因水平上調AQP5的表達，以實現對肺損傷組織的保護。

［1］楊紅娟，蔚京京，張衛紅，等.血紅素加氧酶-1對急性肺損傷大鼠水通道蛋白1，5表達的影響［J］.國際呼吸雜志，2014，34（2）：91-95.

［2］羅東，張家衡，柯有力，等.防己黃芪湯對兔肺缺血再灌注后肺水腫的保護作用［J］.吉林中醫藥，2014，34（8）：829.

［3］李竹英，王晶波.通腑湯對急性肺損傷大鼠肺組織中TGF-1的影響［J］.吉林中醫藥，2010，30（9）：811-812.

［4］鄧青南，周建龍，郭振輝，等.半夏提取物對氣道黏液高分泌的影響［J］.中國呼吸與危重監護雜志，2009，8（5）：477.

［5］JIAO G Y，LIE R，YU R J.Decreased expression of AQP1 and AQP5 in acute injured lung in rats［J］.Chin MED J，2002（7）：963-967

［6］高巨，招偉賢，肖建斌，等.失血性休克-內毒素二次打擊所致肺損傷水通道蛋白的表達［J］.中國急救醫學，2007，27 （6）：546-548.

［7］王聰，史鎖芳.史鎖芳教授治療急性病毒性上呼吸道感染發熱的經驗［J］.吉林中醫藥，2011，31（2）：103-104.

［8］韋麟.益肺止咳飲治療慢性支氣管炎急性發作50例［J］.吉林中醫藥，2011，31（6）：547-548.

［9］焦成芹.清氣化痰丸加減治療老年急慢性咳喘［J］.長春中醫藥大學學報，2010，26（6）：881.

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Effect on extracts of pinellia（EP）on expression of aquaporin 5 in m ice

ZHOU Jianlong，DENG Qingnan，LIANG Jing
（Guangzhou Military General Hospital，Guangzhou 510010，China）

Objective To investigate lung tissue aquaporin 5（AQP5）expression changes in acute lung injury（ALI）mice，and to explore the pharmacologicalmechanism of extracts of pinellia（EP）in the treatmentof acute lung injury.Methods 36 Kunmingmice were randomly divided into three groups，namely the blank control group（NS group），lung injury model group（ALIgroup）and pinellia extract treatment group（EP group）.After six hours，lung tissue wet/dry weight ratio（W/D）were observed and determined，lung tissue histopathological changeswere observed by HE staining，serum concentrations of TNF-αinmice were detected by ELISA and lung tissue AQP5 mRNA expressionswere detected by RT-PCR.Results Reflection of lung inflammation in mice in ALI group was significant，with main neutrophil infiltration as well asmarked alveolar edema and hyperemia.Lung inflammation in EPgroup was alleviated and the edemawas reduced.Compared with the NSgroup and EP group，W/D value difference was statistically significant in ALI group（P＜0.05）；Compared with NS group，AQP5mRNA expression decreased significantly and TNF-αin blood were higher in ALIgroup（P＜0.05）.Compared with ALIgroup，AQP5mRNA expression increased significantly and TNF-αin blood were lower in EP group（P＜0.05）.

Conclusion EP can reduce pulmonary edema by upregulating the expression of lung AQP5 which whosemechanism may be related with the inhibition of TNF-α.

lung injury；extracts of pinellia；aquaporin 5；mice

book=229,ebook=15

R285.5

A

2095－6258（2015）02－0229－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.02.004

2014－10－28）

廣東省中醫藥管理局基金（20131134）。

周建龍（1981－），男，碩士，主治醫師，主要從事中西醫治療內科、腫瘤等疾病研究。