健骨伸筋湯對大鼠膝關節軟骨細胞增殖與凋亡的影響

劉洪波，靖春穎通信作者：靖春穎，碩士，講師，電話－5008060706，謝毅強，韓 平（.海南醫學院中醫學院，海口5799；.海南醫學院附屬醫院中醫科，海口5700）

健骨伸筋湯對大鼠膝關節軟骨細胞增殖與凋亡的影響

劉洪波1，靖春穎1*通信作者：靖春穎，碩士，講師，電話－15008060706，謝毅強1，韓 平2
（1.海南醫學院中醫學院，海口571199；2.海南醫學院附屬醫院中醫科，海口570102）

目的 探討健骨伸筋湯對大鼠膝關節軟骨細胞增殖與凋亡的影響。方法 采用改良的Hulth法造模，造模2周后，開始對空白對照組、模型組生理鹽水灌胃；對照組壯骨關節丸灌胃；治療組分低、高濃度進行中藥灌胃，第13周處死，通過免疫組化、TUNEL法檢測軟骨細胞的增殖與凋亡。說明健骨伸筋湯可以通過調節軟骨細胞的增殖與凋亡防治骨關節炎。結果 健骨伸筋湯方含藥血清各濃度組的軟骨細胞增殖指數值明顯高于對照組及模型組（P＜0.05），軟骨細胞凋亡率明顯低于對照組及模型組（P＜0.05）。結論 健骨伸筋湯可以促進軟骨細胞的增殖，還可以抑制軟骨細胞異常凋亡，從而起到防治骨關節炎的作用。

健骨伸筋湯；大鼠；膝關節軟骨細胞；增殖與凋亡

健骨伸筋湯是治療膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）的經驗方，經長期的臨床運用及觀察發現，健骨伸筋湯可減緩骨性關節炎發展［1］。骨關節炎是一種最常見的非化膿性、慢性骨關節病。臨床上主要分為原發性和繼發性［2］。主要表現為關節疼痛、僵硬、腫大、畸形及功能障礙，而且還常伴有繼發性滑膜炎等疾病。中醫中藥在改善臨床癥狀，提高患者生活質量方面［3-4］能起到很好的效果。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 40只SPF級雌性健康4月齡SD大鼠，空腹體質量120～150 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司（許可證號：SCXK〔湘〕2009-0012）。

1.2 實驗藥品及試劑 健骨伸筋湯：由海南醫學院藥學院制備，按人與動物體表面積折算等效計量比值折算成大鼠生藥量。濃縮含生藥2 g/mL，4℃保存。DMEM培養基、胎牛血清FBS、Ⅱ膠原酶（Sigma，美國），購自海南綠葉生物制藥有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組 40只雌性SD大鼠隨機分為5組，每組8只：A組（空白對照組）、B組（造模組）、C組（壯骨關節丸組）、D組（健骨伸筋湯低劑量組）、E組（健骨伸筋湯高劑量組）。

2.2 造模方法 通過改良的Hulth法（取背側切口切除雙側卵巢，再按照Hulth［5］法）：將大鼠麻醉后，仰臥于手術臺上，無菌條件下取膝關節內側縱切口長約2 cm，顯露膝關節，然后切斷前后交叉韌帶及內側副韌帶，完整切除內側半月板，注意勿損傷關節軟骨面，制成腎虛型大鼠的膝骨性關節炎模型。術畢無菌敷料包扎，不固定傷肢。術后每天每只大鼠肌肉注射青霉素 20萬 U，共 1周。術后每天強迫大鼠活動30 min。2周后隨機處死造模成功的1只大鼠，切取雙側股骨髁軟骨處理后，電鏡下觀察，證實造模成功后進入實驗研究。

2.3 給藥方法 造模成功后，開始對空白對照組、模型組0.9％生理鹽水灌胃；治療組分低（含生藥濃度20％）、高（含生藥濃度80％）濃度進行中藥灌胃（中藥方劑：骨碎補、鹿銜草、丹參、牛膝、薏苡仁、五加皮、穿山龍）。對照組：壯骨關節丸；大鼠劑量（mg/kg）＝系數（6.25）×人的劑量（mg/kg）［6］。

2.4 取材 全部動物在13周末處死，立即解剖右側膝關節，銳刀片切取1 cm3大小股骨內髁全層軟骨，置入無菌平皿，帶入超凈工作臺。尖刀片削下每個關節表面的軟骨，D-Hanks液充分漂洗后用眼科剪剪碎至1mm3大小，移至小錐形瓶中，加入0.25％的胰蛋白酶溶液于37℃攪拌消化15 min。1 200 r/min離心5min，去上清液，后加入0.2％Ⅱ型膠原酶5mL，置磁力攪拌器上37℃消化45 min。過濾，離心，吸棄上清，加入10％小牛血清的DMEM培養液混勻終止消化，并把細胞懸液稀釋成（2～3）×105個/mL，接種于25 cm2培養瓶中，置CO2培養箱里常規原代培養及傳代培養（溫度37℃，飽和濕度，5％CO2，95％空氣），用于RT-PCR檢測［7］。

免疫組化檢測軟骨細胞增殖 行5μm厚的切片，常規脫蠟入水，雙蒸水、PBS洗5 min×3次；20μg/mL蛋白酶K37℃消化15 min，PBS沖洗5 min×3次；3％ H2O2-甲醇中25 min，PBS沖洗5 min×3次，加入一抗（鼠抗人PCNA）37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，加入二抗（生物素IgG）及鏈霉素-生物素-過氧化酶溶液30 min，PBS沖洗5 min×3次，SABC（1∶100）30min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，中性樹膠封片。顯微鏡下計算陽性細胞所占比例（增殖陽性細胞黃色），隨機檢驗10～15個視野，至少計數2 500個軟骨細胞，算出增殖指數（增殖指數＝增殖率×100）。

TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡 行5μm厚的切片，常規脫蠟入水，20μg/mL蛋白酶 K37℃消化15min，3％H2O2-甲醇中25 min，TUNEL反應混合液中37℃90min，5％羊血清室溫封閉20 min，POD37℃孵育30min，堿性磷酸酶染色，中性樹膠封片。算出凋亡指數（即每張切片選取5個陽性細胞數（細胞核中有棕黃色顆粒者）最多的高倍視野（×400），計算500個腺泡細胞中陽性細胞所占百分比）。

2.5 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件分析，計量數據采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用 t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 免疫組化檢測軟骨細胞增殖 統計分析可知健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組和壯骨關節丸組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），說明健骨伸筋湯高劑量、低劑量和壯骨關節丸對骨性關節炎模型關節軟骨有修復作用；健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組和壯骨關節丸組比較差異有統計學意義（P＜0.05），說明健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組治療效果優于壯骨關節丸組；健骨伸筋湯高劑量組和低劑量組比較差異有統計學意義（P＜0.05），說明健骨伸筋湯高劑量組治療效果優于低劑量組（見表1）。

3.2 TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡 凋亡的軟骨細胞核呈棕黃色，主要分布在軟骨的淺層和中層。空白對照組陽性細胞表達最低，健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組和壯骨關節丸組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），說明健骨伸筋湯高劑量、低劑量和壯骨關節丸較好的抑制了軟骨細胞的凋亡；健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組和壯骨關節丸組比較差異有統計學意義（P＜0.05），說明健骨伸筋湯高劑量組、低劑量組抑制軟骨細胞凋亡效果優于壯骨關節丸組；健骨伸筋湯高劑量組和低劑量組比較差異有統計學意義（P＜0.05），說明健骨伸筋湯高劑量組抑制軟骨細胞凋亡效果優于低劑量組（見表2）。

表1 健骨伸筋湯對大鼠軟骨細胞增殖指數的影響（±s，n＝5）

表1 健骨伸筋湯對大鼠軟骨細胞增殖指數的影響（±s，n＝5）

注：與模型組比較，＃P＜0.01；與壯骨關節丸組比較，△P＜0.05；與健骨伸筋湯低劑量組比較，▲P＜0.05

組別 增殖指數正常組 24.70±0.26模型組 17.78±1.87壯骨關節丸組 20.57±1.67＃健骨伸筋湯低劑量組 24.32±2.42＃△健骨伸筋湯高劑量組 33.13±2.42＃△▲

表2 TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡指數比較（±s，n＝5）

表2 TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡指數比較（±s，n＝5）

注：與模型組比較，＃P＜0.05；與壯骨關節丸組比較，△P＜0.05；與健骨伸筋湯低劑量組比較，▲P＜0.05

組別 凋亡指數正常組 3.70±0.26模型組 31.78±1.87壯骨關節丸組 21.57±1.67＃健骨伸筋湯低劑量組 19.32±2.42＃△健骨伸筋湯高劑量組 17.13±2.42＃△▲

4 討論

骨關節炎是一種臨床常見的老年人關節的退行性病變，發病率與年齡密切相關。國內膝骨關節炎流行病學［8］表明，65歲以上患有此病的女性和男性分別高達90％和80％。健骨伸筋湯包括五加皮、獨活、威靈仙、蒼術等中藥，可舒筋活絡，化濕通絡，川芎、乳香、沒藥、紅花、川牛膝、當歸、赤芍強筋骨、祛瘀通經、消腫生肌；白芷、荊芥、防風祛風固表，溫通散寒；木香、川烏頭、草烏頭行氣止痛、消腫生肌，而上藥熏洗、熱敷，溫通更有利于舒筋通絡、溫經止痛、強壯筋骨的功效，臨床上能夠有效改善關節活動度，促進關節功能康復。本實驗結果表明，健骨伸筋湯方含藥血清各濃度組的軟骨細胞增殖指數值明顯高于對照組（P＜0.05），說明其能促進軟骨細胞的增生；而軟骨細胞凋亡率明顯低于對照組（P＜0.05），說明其具有抑制軟骨細胞的異常凋亡的功效。

軟骨損傷屬于中醫筋骨損傷范疇，現代研究認識到軟骨細胞損傷，特別是軟骨細胞凋亡與增殖平衡紊亂是其主要機制［9］。對KOA的研究應從膝關節軟骨細胞著手，因為維持細胞外基質穩定的重要條件是正常的軟骨細胞，KOA關節軟骨退變的關鍵因素是細胞凋亡。軟骨組織工程主要著手點是體外大量擴增種子細胞，然后種植到合適的生物支架中，對支架進行塑形，修復缺損。這就決定了軟骨組織工程的三大要素是種子細胞、生物支架和生長因子［10］。為了給軟骨組織工程的臨床應用提供充足的種子細胞需盡可能開發新的、能夠有效促進軟骨細胞增殖并有效保持細胞表型的藥物［11-12］。

本課題重點從軟骨細胞凋亡與增殖的角度去探討，經本2組實驗結果研究表明：健骨伸筋湯具有促進軟骨細胞的增殖的功效，還可以抑制軟骨細胞異常凋亡，從而起到防治骨關節炎的作用。

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Effects of Jiangu Shenjin decoction on cell proliferation and apoptosis of rat's knee joint chondrocyte

LIU Hongbo1，JING Chunying1*，XIE Yiqiang1，HAN Ping2
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；
2.The Affiliated Hospital to Hainan Medical University，Haikou 570102，China）

Objective To explore the effects of Jiangu Shenjin decoction on the cell proliferation and apoptosis of rat's chondrocyte.Methods By using improved Hulth method molding，after building 2 weeks，the blank control group and model group applying normal saline lavage；The control group using strong bone joints pill to lavage；Treatmentgroup using low and high concentration of Chinese traditionalmedicine to lavage respectively.On the 13 weeks executed，through immunohistochemistry and TUNELmethod to detect cartilage cell proliferation and apoptosis.Explain Jiangu Shenjin decoction can prevented and treatmentofosteoarthritis by adjust the cartilage cell proliferation and apoptosis.Results The increased index of all dosage of Jiangu Shenjin decoction were significantly higher than control group and molding group（P＜0.05），and the apoptosis rate of chondrocytewas significantly lower than control group andmolding group（P＜0.05）.Conclusion Jiangu Shenjin decoction can improve the cell proliferation activity and obstruct the abnormal apoptosis of chondrocyte，so as to prevent osteoarthritis from happening.

Jiangu Shenjin decoction；rat；chondrocyte of knee joint；proliferation and apoptosis

book=238,ebook=24

R285.5

A

2095－6258（2015）02－0238－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.02.007

輯：張海洋

2014－10－17）

海南省教育廳高等學校科學研究項目（Hjkj2011-29）。

劉洪波（1978－），男，碩士研究生，講師，主要從事中醫骨傷科學研究。