5種中藥顆粒劑與水煎劑對5種耐藥菌株的體外抑菌作用比較

李藹文，譚俊青，王康椿，黃雙旺，周 兵，劉啟波

(廣東省第二中醫院檢驗科，廣東廣州510095)

目前，抗菌藥物耐藥菌的大量產生增加了臨床患者死亡的危險性[1-2]，尋求能夠對抗多重耐藥菌的替代抗菌藥物[3]已經成為全球關注的一個熱點。中藥抗菌有著悠久的歷史，許多研究表明中藥飲片對多重耐藥細菌有明顯的抑菌作用[4]。單味中藥抑菌作用的研究多以水煎劑居多[5-6]，其作為中醫臨床用藥的傳統劑型，卻有攜帶、煎煮不便的缺點。中藥配方顆粒是以中藥飲片為原料，經現代化制藥技術提取、分離、濃縮、干燥、制粒、包裝而成的顆粒狀劑型，供中醫臨床配方時應用。它既保留了中藥飲片的藥性、藥效，又不需要煎煮，質量可控[7]，是一種安全、高效、方便的現代中藥制劑。目前，國內已可生產多種配方顆粒劑，但它能否保持傳統水煎劑的藥效，尚無明確定論。我們選取了有抑菌作用的5種中藥(苦參、連翹、薄荷、薄公英、黃芩)，采用體外抑菌試驗比較5種中藥顆粒劑與水煎劑對臨床分離的5種多重耐藥菌的抑菌效果，為臨床使用顆粒劑型中藥提供實驗依據。

材料和方法

一、實驗選用材料

1.中藥水煎劑 苦參、連翹、薄荷、蒲公英、黃芩由廣東省第二中醫院中藥房提供并鑒定。

2.中藥顆粒劑 苦參、連翹、薄荷、蒲公英、黃芩中藥顆粒劑由廣東一方藥業公司提供，符合《中國藥典》的規定。

3.臨床耐藥菌株 耐藥菌株為從廣東省第二中醫院呼吸科、重癥監護病房(intensive care unit，ICU)患者尿液、血液、痰標本中分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(meticillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、產金屬酶的銅綠假單胞菌、產β-內酰胺酶的肺炎克雷伯菌，產超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase，ESBL)的大腸埃希菌、天然耐藥的鮑曼不動桿菌。

4.藥敏紙片 阿米卡星、氨芐西林、氨曲南、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢唑啉、慶大霉素、亞胺培南、復方磺胺甲噁唑、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸、氯霉素、頭孢唑啉、環丙沙星、慶大霉素、苯唑西林、青霉素、萬古霉素藥敏紙片均購自Oxoid公司。萬古霉素紙片含量為30 μg，亞胺培南紙片含量為10 μg。

5.儀器及培養基 梅里埃VITEK-2全自動細菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)。血平板購自江門市凱林貿易有限公司(批號140506)。MH平板購自江門凱林貿易有限公司(批號140512)。

二、方法

1.中藥水煎劑的制備 稱取中藥飲片50 g，置于砂鍋中，加10倍量水浸泡過夜，加熱至沸后改用文火煎30 min，趁熱過濾，濾渣另加8倍量水，同法煎煮30 min，過濾，合并2次濾液于同一燒杯中，水浴濃縮后放涼至室溫，并于50 mL容量瓶中定容，再倒入輸液瓶，蓋薄膜，壓膠塞和鋁蓋，高壓(表壓:0.7 kg/cm2，溫度:115℃，時間:30 min)滅菌，取出放涼，即得1 mL相當于原藥材1 g(1∶1)的中藥煎劑溶液。

2.中藥顆粒劑溶液的制備 用分析天平準確稱取5種中藥顆粒劑適量(相當于原中藥飲片50 g)，分別置于燒杯中，用蒸餾水溶解，并在50 mL量筒中定容，再倒入無菌帶蓋容器中，高壓(表壓:0.7 kg/cm2，溫度:115 ℃，時間:30 min)滅菌，取出放涼即得1 mL相當于原藥材1 g(1∶1)的中藥顆粒劑溶液。

3.耐藥菌液的制備 將鑒定后的MRSA、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌在血平板上分純，于37℃的培養箱中培養24 h。培養后取出細菌以生理鹽水校正濃度至0.5麥氏濁度(相當于108CFU/mL)。

4.無菌小紙片的制備 將打孔器制成的小紙片(直徑為5 mm)放入平皿中，高壓(表壓:0.7 kg/cm2，溫度:115℃，時間:30 min)滅菌，取出放涼，即得實驗用的無菌小紙片。

5.體外抑菌試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法進行體外抑菌試驗。用無菌接種環將0.5麥氏濁度的菌液均勻涂布于M-H平板，中間選取一個抗菌藥物紙片做陽性對照(MRSA選取萬古霉素，其它4種細菌選取亞胺培南)，用無菌鑷子在平板四周貼6片無菌的小紙片(5 mm)，左右兩邊各3片，靜置10 min，左邊3片用校準過的加樣槍加入1 g/mL中藥水煎劑溶液10μL，右邊3片同樣加入等量的同種中藥顆粒劑溶液。于37℃的培養箱中培養24 h后用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，分別求出其均值()與標準差(s)。

三、試驗結果判斷標準

中草藥對病原菌的抑菌效果目前國內外尚無統一標準，我們參照國內同類型的實驗[8-9]的標準作為結果的判斷依據:抑菌圈直徑＞20 mm為高度敏感，10～19 mm為中度敏感，＜10 mm為不敏感。

四、統計學方法

結 果

一、5種臨床分離耐藥菌的耐藥譜

見表 1、2。

二、5種中藥對5種耐藥菌的抑菌效果比較

除黃芩、連翹、薄荷對MRSA表現為敏感、黃芩對鮑曼不動桿菌表現為敏感外，其余中藥對5種耐藥菌均表現為不敏感或無抑菌作用。總的來說，黃芩的抑菌效果最好。見表3。

三、同一種中藥水煎劑與顆粒劑的抑菌效果比較

表1 4種革蘭陰性桿菌的耐藥譜

對于MRSA，黃芩、連翹、薄荷、蒲公英、苦參2種劑型均有抑菌效果，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表2 MRSA的耐藥譜

表3 5種中藥水煎劑與顆粒劑對5種耐藥菌的抑菌作用 (±s，mm)

表3 5種中藥水煎劑與顆粒劑對5種耐藥菌的抑菌作用 (±s，mm)

注:－表示無抑菌作用，+表示有抑菌作用

銅綠假單胞菌 大腸埃希菌 肺炎克雷伯菌 鮑曼不動桿菌連翹 顆粒劑中藥 劑型 MRSA 11.10 ±0.50 7.42 ±0.57 － － 6.20 ±0.3水煎劑 12.00±0.30 8.67±0.57 － － 7.10±0.5蒲公英 顆粒劑 7.10±0.20 － － － －水煎劑 7.66±0.30 － － － －黃芩 顆粒劑 19.00 ±0.90 6.65±0.10 7.6 ±0.3 6.2±0.57 11.00 ±0.5水煎劑 20.36 ±0.50 7.00 ±0.20 8.1 ±0.2 7.1 ±0.10 12.10 ±0.5薄荷 顆粒劑 13.70±0.14 6.50±0.59 － － 7.60±0.2水煎劑 15.35±0.57 7.83±0.59 － － 8.10±0.3苦參 顆粒劑 6.80±0.10 － － － －水煎劑 7.30±0.30 － － － －陽性對照+++++

對于耐藥性銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌，黃芩、連翹、薄荷2種劑型均有抑菌效果，差異無統計學意義(P＞0.05);蒲公英，苦參2種劑型均無抑菌效果。

對于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌，黃芩的2種劑型有抑菌效果，差異無統計學意義(P＞0.05);連翹、薄荷、蒲公英、苦參2種劑型均無抑菌作用。

討 論

本研究選用的耐藥菌株均從臨床分離所得，對多種抗菌藥物耐藥。研究結果顯示，5種中藥無論顆粒劑或水煎劑對5種耐藥菌株的抑菌作用各不相同。其中，黃芩抑菌效果最好，其2種劑型均對MRSA、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌有一定的抑菌效果。連翹、薄荷對MRSA、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌亦有一定的抑菌效果。雖然抑菌圈大小有一定的差異，敏感性亦不同，但提示這幾種常用的中藥有很好的應用前景，可用于細菌耐藥性的研究，通過進一步分析體內抑菌活性，更好地指導臨床用藥。

同一種中藥水煎劑與顆粒劑相比，同濃度的黃芩、連翹、薄荷、蒲公英、苦參，顆粒劑和水煎劑抑菌效果差異不明顯。這與王育紅等[10]的報道不一致。很多研究結果顯示在體外抑菌試驗(試管倍比稀釋法)中，中藥水煎劑明顯要比顆粒劑抑菌效果好。分析與報道不一致的原因，可能有以下幾方面的影響因素。

首先，與制備工藝和過程有關。中藥湯劑一直沿用“一只砂鍋二碗水，頭煎二煎服下肚”的傳統煎煮方法，既無加工工藝，又無質量標準，而且中藥煎煮涉及到藥材的浸泡、先煎后下、水量、火候、煎煮時間、煎煮容器等問題，操作相對復雜，在實際應用過程中，使飲片活性成分提取受到一定限制。導致煎劑出現質量不穩定、溶解不充分等缺點。李學林等[11]證明不同的煎煮方法對中藥煎液的質量影響很大。

單味中藥濃縮顆粒是按照國家中醫藥管理局《單味中藥濃縮顆粒研制指南》要求，采用符合炮制規范的中藥飲片為原料，經現代化科學提取、低溫濃縮、噴霧干燥、干壓制劑制成的現代“飲片”顆粒。其性味、歸經、功能主治、用法用量與原中藥飲片完全一致。但仍存在一些問題，如尚缺少統一的質量控制標準、包裝規格少、對單味中藥濃縮顆粒的應用劑量和原飲片劑量沒有科學的折算等。同時，在配制過程中，顆粒劑稱取的量和溶解性等問題有可能會導致顆粒劑的實際濃度比理論濃度高。因此，這就需要科研人員不斷挖掘與探索中藥藥效，分析其物理與化學特性，并與更多的水煎劑比較，為其臨床使用顆粒劑型中藥提供實驗依據。

其次，與實驗方法也有關。本研究采用藥敏紙片法，是一種半定量的試驗方法，操作簡便，工作量小，但紙片所吸附的藥量不易確定，且吸附到紙片上的藥液擴散不同，故可能會影響藥物的抑菌效果[12]。試管連續稀釋法[13]操作的工作量大，但它能夠精確測出各種中草藥的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。而且藥物在液體環境中，抑菌有效成分具有較好的擴散性，能持續地作用于細菌。因此，應進一步做試管稀釋法，測定MIC，更準確地判斷顆粒劑與水煎劑的抑菌效果。

中草藥的清熱解毒藥理作用，主要體現為抗病原微生物、抗病毒、清熱、抗炎、增強機體免疫力等，故深入研究中藥對細菌的體內體外的抑菌作用，無論是顆粒劑或水煎劑，對控制耐藥菌的感染與蔓延具有非常重要的實際意義。

[1]LEE HH，MOLLA MN，CANTOR CR，et al.Bacterial charity work leads to population-wide resistance[J].Nature，2010，467(7311):82-85.

[2]KOHANSKI MA，DEPRISTOMA，COLLINSJJ.Sublethal antibiotic treatmentleads to multidrug resistance via radical-induced mutagenesis[J].Mol Cell，2010，37(3):311-320.

[3]李繼霞，公衍文.多重耐藥菌醫院感染狀況分析[J].檢驗醫學，2013，28(9):784-788.

[4]陳美玲，王劍，周紅霞，等.中藥飲片對多重抗生素耐藥細菌的抑菌作用[J].中醫藥學報，2012，40(2):10-13.

[5]李建志，劉文麗，王亞賢.9種中草藥抗菌作用實驗研究[J].中醫藥學報，2012，40(1):45-46.

[6]岳云升，李仲興，王秀華，等.用新方法進行大黃對308株臨床菌株抗菌活性研究[J].航空航天醫藥，2004，15(1):16-18.

[7]楊家福.中藥配方顆粒的研究進展[J].中國醫療前沿，2007，2(19):30-31.

[8]杜銳，韓文瑜，雷連成.金黃色葡萄球菌中草藥抑菌劑的篩選研究[J].中國獸藥雜志，2006，52(9):10-13.

[9]黃玲，林居純，馬馳，等.12種中藥的體外抑菌試驗[J].動物醫學進展，2010，31(6):50-52.

[10]王育紅，李風學，張志清，等.24種中藥水煎劑與免煎顆粒劑對臨床菌株的體外抑菌作用[J].江蘇中醫藥，2006，27(4):52-54.

[11]李學林，陳天朝，張曉東，等.不同煎藥方法對中藥煎藥質量的影響[J].中醫雜志，2004，45(1):71.

[12]林炳炎.中草藥抑菌試驗方法研討[J].廣后醫學，1989，8(3):51-53.

[13]許興全.藍芩口服液的體外抑菌作用[J].現代醫藥衛生，2007，23(3):423.