丹參酮ⅡA改善膿毒癥大鼠腦組織損傷和凋亡的實驗研究*

劉 芳 馮 俊 周文秀 楊 俊

（1.湖北省武漢市第十一醫院，湖北 武漢 430030；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030）

·研究報告·

丹參酮ⅡA改善膿毒癥大鼠腦組織損傷和凋亡的實驗研究*

劉 芳1馮 俊2△周文秀1楊 俊1

（1.湖北省武漢市第十一醫院，湖北 武漢 430030；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030）

目的探討丹參酮ⅡA改善膿毒癥大鼠腦組織損傷和細胞凋亡的作用及可能的機制。方法采用盲腸結扎穿孔術制備膿毒癥大鼠模型（CLP），給予丹參酮ⅡA腹腔注射處理。分析治療6～24 h后腦組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平、病理學變化、細胞凋亡率、促凋亡基因Bax、Fas、P53和Caspase-3和抑制凋亡基因Bcl-2的表達情況。結果（1）膿毒癥大鼠中TNF-α和IL-1β水平顯著升高（P＜0.05），并隨著炎癥反應的持續呈逐漸上升趨勢（P＜0.05），而丹參酮ⅡA可以抑制膿毒癥大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β水平的升高 （P＜0.05）；（2）膿毒癥大鼠中MDA水平明顯升高 （P＜0.05），SOD水平顯著降低（P＜0.05），隨著炎癥反應的持續呈逐漸惡化趨勢（P＜0.05）；丹參酮ⅡA干預后，MDA和SOD的異常水平顯著改善 （P＜0.05）；（3）膿毒癥組大鼠造模后6 h腦組織已出現病理學的異常改變，并隨著炎癥反應的持續呈逐漸加重趨勢，細胞凋亡指數顯著高于假手術組（P＜0.05）；給予丹參酮ⅡA處理之后，病理學的異常改變得到明顯的改善，凋亡指數顯著降低（P＜0.05）；（4）Bcl-2的蛋白和mRNA表達水平下降（P＜0.05），隨著炎癥反應的持續呈逐漸下降趨勢（P＜0.05）；p53、Bax、Fas和Caspases-3蛋白和mRNA表達水平升高（P＜0.05），并隨著炎癥反應的持續呈逐漸上升趨勢（P＜0.05）；丹參酮ⅡA干預可以使上述蛋白和mRNA的異常表達水平部分恢復（P＜0.05）。結論丹參酮ⅡA具有改善膿毒癥大鼠腦組織損傷和細胞凋亡的作用，可能機制是通過其抗炎（TNF-α、IL-1β）、抗氧化（MDA、SOD）的作用，并調控凋亡相關基因（Bcl-2、Bax、p53、Fas、Caspase-3）的表達來實現。

丹參酮ⅡA 膿毒癥 腦損傷 凋亡

膿毒癥是一種由炎性、氧化等多種因子參與的嚴重的全身性炎癥反應，可導致腦組織神經元細胞的損傷、凋亡以及功能異常等；腦組織細胞凋亡是腦組織炎癥反應的主要病理過程，與不可逆細胞壞死不同，神經細胞凋亡可能通過早期干預而加以挽救［1-2］。因此，防止腦組織炎癥反應誘導的神經細胞凋亡的發生，對于保護腦功能具有重要意義。丹參酮ⅡA是傳統中藥丹參的主要成分，研究表明其具有抗炎、清除自由基以及增強抗氧化活性等功效，對多種心腦血管疾病具有保護作用［3-5］。但目前對其是否可改善膿毒癥腦組織的細胞凋亡及其具體機制研究較少；本實驗采用盲腸結扎穿孔手術建立膿毒癥大鼠模型，觀察丹參酮ⅡA預處理對膿毒癥大鼠腦組織損傷和細胞凋亡的影響，探討丹參酮ⅡA對膿毒癥腦損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物及試劑

SPF級雄性Sprague Dawley大鼠54只，體質量280～300 g（由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供），丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（諾新康，2 mL∶10 mg；上海第一生化藥業有限公司，國藥準字H31022558），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素（IL）-1β Elisa試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶塞生物技術有限公司。蛋白抗體購于Cell Signaling Technolgy公司。PCR引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成；其余試劑為國產分析純（武漢康盛醫藥科技有限公司）。

1.2 實驗分組

根據實驗設計隨機分為3組：假手術組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）、膿毒癥+丹參酮ⅡA治療組（CLP+TanⅡA組），每組18只；CLP+TanⅡA組術后于腹腔注射40 mg/d的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，其余兩組均給予0.9%氯化鈉注射液對照；3組大鼠均于同一環境下飼養。模型制成后，每組分別于6、12、24 h斷頭處死，取腦組織進行實驗指標檢測。

1.3 方 法

1.3.1 模型制作 采用盲腸結扎穿孔手術（CLP）制作膿毒癥模型；3組大鼠均在術前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg），充分麻醉后置于仰位，消毒腹部皮膚，于中下腹部做3 cm縱切，打開腹腔，通過鈍性分離及游離操作，充分暴露盲腸，僅CLP組和CLP+ TanⅡA組于距盲腸末端1 cm處采用3號縫合線環形結扎，保證腸道通暢，并據結扎處5 mm位置采用9號針頭貫穿盲腸2次，并輕擠壓確保糞便溢出，并進行后續的關閉腹腔手術。Sham組僅做盲腸探查術。

1.3.2 大鼠腦組織中 TNF-α、IL-1β、MDA含量及SOD活性的測定 取腦組織制備組織勻漿，取上清液備用。酶聯免疫吸附法測定TNF-α、IL-1β的含量，羥胺法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，操作步驟按相關試劑盒說明書進行。

1.3.3 HE染色光鏡檢查 常規石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯，Harris蘇木精染核，0.1 mol/L鹽酸乙醇返藍，至水洗，入0.1 mol/L伊紅水溶液染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片鏡檢。

1.3.4 透視電鏡檢查 將每個大腦冠狀切片再進一步分成大小為1 mm×1 mm×2 mm的4～5塊，經2.5%戊二醛及1%鋨酸雙重固定后，丙酮逐級脫水，樹脂包埋，做超薄切片，厚度為50 nm，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，JEM 1200-EX型透視電鏡觀察并拍照。

1.3.5 細胞凋亡檢測 細胞凋亡檢測采用原位缺口末端標記法（TUNEL法），具體操作嚴格按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。凋亡的細胞核被染成棕黃色，未凋亡的細胞核為深藍色。高倍鏡下每張切片隨機選取10個視野，計數凋亡陽性細胞，以凋亡指數（AI）反映各組心肌凋亡的情況，AI=（視野內凋亡細胞個數/視野內所有心肌細胞個數）×100%。

1.3.6 促凋亡基因Bax、p53、Fas和Caspase-3、抑制凋亡基因 Bcl-2的蛋白水平檢測 采用 Western blot法。具體步驟見Zhu等［10］的報道，簡述如下：待提取好的將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸后，進行10% SDS-PAGE電泳，采用半干轉進行蛋白轉膜，根據要求分別加入Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2的一抗孵育過夜，待完成二抗孵育后進行ECL顯示處理，將數據進行Gel-Pro analyzer分析光密度，最終結果以Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2和 β-actin的光密度比值表示。

1.3.7 促凋亡基因Bax、p53、Fas和Caspase-3、抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA水平檢測 采用RT-PCR檢測。具體方法參見Alaaeddine等［11］的報道，采用ΔΔCt法分析Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2的擴增效果，并與β-actin做標準化處理，結果均以2-ΔΔCt來表示。

Bax：引物1（forward）5′-CCAAGAAGCTGAGCGA GTGTCTC-3′；引物2（reverse）5′-AGTTGCCATCAGCA AACATGTCA-3′。Caspase-3：引物1（forward）5′-TACC CTGAAATGGGCTTGTGT-3′；引物2（reverse）5′-GTTAACACGAGTGAGGATGTG-3′。Bcl-2：引物1（forward）5′-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3′；引物2（reverse）5′-CAGGATGCGTCCACCAAGAAGCTG-3′。P53：引物1（forward）5′-GTGGCCTCTGTCATCTT CCG -3′；引物2（reverse）5′-CCGTCACCATCAGAGCA ACG -3′。擴增產物長度291 bp。Fas：引物1（forward）5′-CCAAATGCAGAAGATGATTGTGTG-3′；引物2（reverse）：5′-TGCCACTGTTCAGGATTTAAAGGTTG-3′。擴增產物長度258 bps。β-actin：引物1（forward）5′-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′；引物2（reverse）5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠心肌組織中炎性、氧化因子水平

見表1。與Sham組6、12、24 h 3個時間點比較，膿毒癥組大鼠心肌組織中6、12、24 h對應時間點測得的TNF-α、IL-1β和MDA含量升高，SOD活性降低（P＜0.05），且呈時間依賴性，丹參酮ⅡA可改善膿毒癥導致的心肌組織TNF-α、IL-1β、MDA含量和SOD活性的異常改變（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌組織中炎性、氧化因子水平的變化（±s）

表1 各組大鼠心肌組織中炎性、氧化因子水平的變化（±s）

與Sham組比較，*P＜0.05；與CLP組比較，△P＜0.05。

T N F -α（p g / m L） I L -1 β（p g / m L） S O D（U / m g）M D A（n m o l / m L）1 7 . 3 7 ± 3 . 2 7 3 . 3 4 ± 0 . 2 5 1 7 . 7 3 ± 2 . 7 4 1 . 8 7 ± 0 . 2 2 1 6 . 8 3 ± 3 . 1 4 3 . 2 3 ± 0 . 2 9 1 6 . 8 9 ± 2 . 4 4 1 . 9 0 ± 0 . 1 9 1 7 . 1 8 ± 3 . 2 0 3 . 2 6 ± 0 . 2 1 1 7 . 5 7 ± 2 . 2 8 1 . 9 2 ± 0 . 1 6 C L P組 6 h 3 1 . 0 5 ± 5 . 4 2* 7 . 3 8 ± 2 . 2 4* 8 . 0 2 ± 0 . 4 1* 3 . 0 8 ± 0 . 1 8*（n = 1 8） 1 2 h 4 9 . 3 3 ± 7 . 0 7* 1 1 . 2 4 ± 3 . 4 7* 6 . 3 0 ± 0 . 3 7* 5 . 0 2 ± 0 . 2 0*2 4 h 6 3 . 7 1 ± 8 . 8 7* 1 6 . 3 8 ± 4 . 2 5* 5 . 1 7 ± 0 . 4 1* 6 . 3 9 ± 0 . 2 6*C L P + T a nⅡA組 6 h 2 7 . 7 5 ± 4 . 2 9*△ 6 . 0 3 ± 0 . 5 1*△ 1 1 . 2 4 ± 1 . 0 2*△ 2 . 4 2 ± 0 . 1 3*△（n = 1 8） 1 2 h 2 9 . 0 5 ± 3 . 3 7*△ 5 . 7 4 ± 0 . 4 2*△ 1 0 . 9 3 ± 0 . 9 4*△ 2 . 5 5 ± 0 . 1 1*△2 4 h 2 8 . 7 4 ± 4 . 0 5*△ 5 . 8 7 ± 0 . 4 6*△ 1 0 . 8 5 ± 0 . 8 5*△ 2 . 5 9 ± 0 . 1 3*△組別 時間S h a m組 6 h（n = 1 8） 1 2 h 2 4 h

2.2 腦組織HE染色

Sham組腦組織結構完整，胞核、胞漿染色均勻，無明顯異常改變（圖A～C）。膿毒癥組于術后6 h處死時，HE染色可見神經元及細胞間隙發生水腫，組織結構疏松，少量的炎癥細胞浸潤（圖D）。術后12 h可見神經元胞體明顯腫脹，少量膠質細胞增生，炎癥細胞浸潤明顯，病灶周圍組織疏松水腫，細胞間隙增寬（圖E）。術后24 h可見腦組織高度水腫，液化壞死，大量炎癥細胞浸潤，神經元明顯變性壞死，核結構模糊，膠質細胞增生（圖F）。與CLP組比較，丹參酮ⅡA干預后神經細胞也可見水腫，但細胞層次較清楚，排列較緊密，細胞結構較完整，神經細胞腫脹、變性明顯減輕（圖G～I）。

圖1 光鏡下腦組織形態學改變（HE染色×200）

2.3 腦組織電鏡

Sham組腦組織神經細胞核大而圓，染色質均勻分布，核仁明顯，核膜完整清晰，胞質內見高爾基器分布于核周，粗面內質網、線粒體散在分布，表面附著核糖體，線粒體呈圓形、橢圓形，內嵴清晰可見，基質均勻（圖A～C）。CLP組術后6 h細胞皺縮變小，核固縮呈不規則形狀，核內染色質分布欠均勻，形成染色質塊，分布于核膜周邊部，電子密度高于正常，核仁消失，核膜完整（圖D）；術后12 h核膜尚完整，染色質更加致密、均質無結構，電子密度更高（圖E）；術后24 h細胞染色質凝聚、移動，分布于核周，進而裂解成幾個碎片，出現各種形態，如花瓣狀、馬蹄形等（圖F）。與CLP組比較，丹參酮ⅡA干預后，細胞核結構尚完整，核膜結構尚清晰，染色質輕度濃縮邊集化；內膜系統部分擴張或成空泡狀，部分線粒體水腫，嵴排列紊亂，有的空泡化（圖G-I）。

2.4 腦組織細胞凋亡

光鏡下Sham組6～24 h模型中少見凋亡細胞 （圖A～C）。CLP組可見較大量凋亡細胞（細胞核內可見棕黃色顆粒，圖G～I），較Sham組明顯增多，細胞凋亡指數顯著高于Sham組（P＜0.05，圖J）；給予丹參酮ⅡA處理之后，凋亡細胞較CLP組明顯減少（圖D～F），凋亡指數顯著降低（P＜0.05，圖J），但仍高于Sham組大鼠（P＜0.05，圖J）。

圖2 腦組織神經元電鏡（×6000）

圖3 3組腦組織TUNEL染色（TUNEL，10×40）

2.5 3組凋亡相關基因蛋白水平比較

與Sham組相比，CLP處理可導致腦組織神經細胞的 Bax、fas、p53以及 Caspase-3的蛋白水平上升（P＜0.05），Bcl-2的蛋白水平下降（P＜0.05），丹參酮ⅡA處理后可使上述凋亡相關基因的蛋白水平部分恢復（P＜0.05）。見圖4。

2.6 3組凋亡相關基因mRNA水平比較

與Sham組比較，CLP處理可導致腦組織神經細胞的Bax、fas、p53以及Caspase-3的mRNA水平上升（P＜0.05），Bcl-2的mRNA水平下降（P＜0.05）；丹參酮ⅡA處理后可使上述凋亡相關基因的mRNA水平部分恢復（P＜0.05）。見圖5。

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，伴有大量的炎癥介質釋放、眾多促炎細胞因子的產生以及白細胞的粘附和浸潤等［6］，這些因素可引起腦組織的急性炎癥反應，加重腦組織的缺血缺氧程度，其神經細胞在經過幾小時或幾日后發生凋亡，引起腦功能的損害［7-8］。因此，通過早期干預減少膿毒癥腦神經細胞凋亡具有重要的臨床意義。

圖4 3組凋亡相關基因蛋白水平比較

圖5 3組細胞凋亡相關基因mRNA水平比較

丹參的有效成分丹參酮ⅡA具有抗炎、抗氧化以及清除自由基等作用，對多種腦血管疾病具有保護作用［3］。本研究發現，CLP組大鼠造模后6 h腦組織已出現病理學改變，并隨著炎癥反應的持續呈逐漸加重趨勢（HE染色光鏡下顯示細胞水腫、組織結構疏松、炎癥細胞浸潤，電鏡下顯示細胞核細胞高度水腫、胞體不規則突起，可見核固縮、核裂解、核溶解），光鏡下CLP組可見較大量凋亡細胞（細胞核內可見棕黃色顆粒，圖3：G-I），較Sham組明顯增多，細胞凋亡指數顯著高于Sham組（P＜0.05，圖3：J）；給予丹參酮ⅡA處理之后，上述病理學改變得到明顯的改善，凋亡細胞較CLP組明顯減少（圖3：D-F），凋亡指數顯著降低（P＜0.05，圖3：J）。提示通過早期給予丹參酮ⅡA干預能減少膿毒癥腦組織的損傷和細胞的凋亡。

炎性、氧化反應是導致細胞損傷和凋亡的重要因素［9］；TNF-α是參與膿毒癥全身炎性反應的重要細胞因子［10］，可激活核因子κB介導其他細胞因子（如IL-1、IL-6、IL-8）的合成與釋放，啟動炎癥級聯反應，從而導致炎癥反應失控［11-12］。本實驗觀察到，膿毒癥大鼠中TNF-α和IL-1β水平顯著升高，并隨著炎癥反應的持續呈逐漸上升趨勢，而丹參酮ⅡA可以抑制膿毒癥大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β水平的升高，提示其可以通過抑制膿毒癥大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β的浸潤發揮抗炎作用。此外，氧化應激是炎癥反應中的重要環節，在炎癥反應過程中可產生大量氧自由基，誘導細胞凋亡［13-15］。筆者發現膿毒癥大鼠腦組織中，作為膜脂過氧化最重要產物之一的MDA水平明顯升高，而生物體內重要的抗氧化酶SOD水平顯著降低，隨著炎癥反應的持續也呈逐漸惡化趨勢；丹參酮ⅡA干預后，MDA和SOD水平顯著改善；提示丹參酮ⅡA具有抗氧化作用，通過抗膜脂過氧化抑制炎癥引起的腦組織損傷和細胞的凋亡。

綜上所述，丹參酮ⅡA具有改善膿毒癥大鼠腦組織損傷和細胞凋亡的作用，其可能機制是通過其抗炎（TNF-α、IL-1β）、抗氧化（MDA、SOD）的作用，并調控凋亡相關基因（Bcl-2、Bax、p53、Fas、Caspase-3）的表達來實現。

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The Effect of TanshinoneⅡA on improving the Damage and Apoptosis in Brain Tissue of Rats with Sep-sis

LIU Fang，FENG Jun，ZHOU Wenxiu. The 11th Hospital of Wuhan City，Hubei Province，Hubei，Wuhan 430015，China

Objective:To investigate effect and the mechanism of tanshinoneⅡA on improving the damage and apoptosis in brain tissue of rats with sepsis.Methods:Rat sepsis model were made with cecal ligation perforation and tanshinoneⅡA（TanⅡA）intraperitoneal injection treatment.And TNF-α，IL-1β，MDA，SOD level，pathological changes，pro apoptotic gene（Bax，Fas，P53 and Caspase-3）and apoptosis inhibiting gene（Bcl-2）expression of the brain tissue in 6～24 h were analyze.Results:（1）in septic rats，the levels of TNF-alpha and IL-1 beta significantly increased and it increased gradually（P＜0.05）with the sustained inflammation（P＜0.05）.and tanshinoneⅡA can inhibit the elevation of TNF-alpha and IL-1 beta level（P＜0.05）；（2）The level of MDA in rats with sepsis was significantly increased（P＜0.05），the level of SOD decreased significantly（P＜0.05），along with the sustained inflammation worsening（P＜0.05）；with tanshinoneⅡA intervention，abnormal levels of MDA and SOD were improved significantly（P＜0.05）；（3）sepsis rats after modeling in 6h the brain had abnormal changes in pathology and along with the sustained inflammation gradually increasing，apoptosis index was significantly higher than that in sham operation group（P＜0.05）；after TanⅡA treatment，abnormal changes of pathology were improved，the apoptosis index significantly decreased（P＜0.05），④The expression level of Bcl-2 protein and mRNA decreased（P＜0.05），along with the sustained inflammatory reaction decreased（P＜0.05）；the expres-sion level of P53，Bax，Fas and Caspases-3 protein and mRNA increased（P＜0.05），and with the inflammatory reaction gradually rising（P＜0.05）；tanshinoneⅡA intervention can partly recover the abnormal expression of the protein and mRNA（P＜0.05）.Conclusion：TanshinoneⅡA can improve injury and apoptosis in brain tissue of rats with sepsis，the possible mechanism is through its anti-inflammatory（TNF-α，IL-1β）antioxidant（MDA，SOD）function，and regulation of apoptosis related genes（Bcl-2，Bax，Fas，Caspase-3，P53）expressions that achieve the effect.

TanshinoneⅡA；Sepsis；Brain injury；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2015）02-0242-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.02.019

2014-11-6）

湖北省武漢市臨床醫學科研項目（wx14c34）

△通信作者（電子郵箱：378105094@qq.com）