健脾止瀉散對(duì)脾虛泄瀉小鼠PMΦ吞噬功能、血清LZM含量的影響

陳 玲 王 娜

（1.陜西省西安市中心醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.陜西省西安市醫(yī)院醫(yī)院，陜西 西安 710001）

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

健脾止瀉散對(duì)脾虛泄瀉小鼠PMΦ吞噬功能、血清LZM含量的影響

陳 玲1王 娜2

（1.陜西省西安市中心醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.陜西省西安市醫(yī)院醫(yī)院，陜西 西安 710001）

目的探討脾虛泄瀉與巨噬細(xì)胞吞噬功能和血清溶菌酶含量變化的規(guī)律，揭示脾虛泄瀉對(duì)免疫功能的影響；通過(guò)中藥制劑（健脾止瀉散）治療脾虛泄瀉小鼠，觀察療效，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)。方法以幼齡ICR系小鼠為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，用番瀉葉水浸液灌胃建立脾虛型泄瀉動(dòng)物模型，用健脾止瀉散治療，對(duì)其進(jìn)行大便性狀、飲食量、體質(zhì)量和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、血清溶菌酶含量水平進(jìn)行比較。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，脾虛自然恢復(fù)組的小鼠大便稀薄，飲食量、體質(zhì)量明顯降低，同時(shí)其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、血清溶菌酶含量明顯降低（P＜0.01）；與脾虛自然恢復(fù)組相比，健脾止瀉散明顯改善了脾虛泄瀉小鼠的大便性狀，飲食量和體重明顯增加，同時(shí)提高了其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和血清溶菌酶含量水平（P＜0.01）。結(jié)論脾虛泄瀉小鼠存在免疫功能的低下，通過(guò)健脾止瀉散治療不僅改善了脾虛泄瀉小鼠的整體狀況，而且提高了其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和血清溶菌酶含量，從而進(jìn)一步證明健脾止瀉散是治療脾虛泄瀉的有效方劑。

泄瀉 脾虛 健脾止瀉散 免疫功能 實(shí)驗(yàn)研究

小兒泄瀉是由脾胃功能失調(diào)，引起大便次數(shù)增多，性狀改變?yōu)橹鞯牟∽C。是兒科常見(jiàn)病、多發(fā)病之一。發(fā)病年齡多見(jiàn)于2歲以?xún)?nèi)的嬰幼兒，年齡越小，發(fā)病率越高。本病一年四季都可發(fā)生，夏秋季更為多見(jiàn)。近年來(lái)，由于病毒感染的增多，秋冬季節(jié)的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調(diào)查，亞、非、拉三洲5歲以下每年有5億小兒患腹瀉，病死率約為1%~4%，說(shuō)明本病是目前嚴(yán)重危害兒童健康的疾病之一［1］。如此眾多的患兒，如果得不到及時(shí)、有效、系統(tǒng)的治療，遷延日久形成脾虛泄瀉，會(huì)存在不同程度的消化吸收障礙，營(yíng)養(yǎng)不良，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和免疫功能低下，嚴(yán)重影響小兒的身心健康。因此本病深受廣大家長(zhǎng)和醫(yī)務(wù)工作者的重視。本實(shí)驗(yàn)以幼齡小鼠為研究對(duì)象，用番瀉葉水浸液灌胃建立脾虛型泄瀉動(dòng)物模型，并設(shè)立對(duì)照組，測(cè)定實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和血清溶菌酶含量水平，觀察其變化的規(guī)律，以探討脾虛泄瀉與免疫功能的關(guān)系；觀察健脾止瀉散的療效，從而為指導(dǎo)臨床實(shí)踐及開(kāi)發(fā)中藥及復(fù)方制劑做出有益的探索，具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值和社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只清潔級(jí)幼齡ICR系小鼠，雌雄各半，40~50 d齡，體質(zhì)量（20±2）g，由陜西中醫(yī)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第08-24號(hào)）。

1.2 藥品

番瀉葉以沸水浸漬濃縮成100%水浸液 （含生藥量1.0 g/mL），造模用。購(gòu)自陜西中醫(yī)學(xué)院金秋門(mén)診中藥房。健脾止瀉散：黨參10 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，薏苡仁10 g，干姜3 g，訶子3 g，烏梅3 g，甘草6 g。常規(guī)煎法制成濃縮液（含生藥量1.0g/mL），冷藏保存150mL。購(gòu)自陜西中醫(yī)學(xué)院金秋門(mén)診中藥房。

1.3 試劑與實(shí)驗(yàn)器械

溶菌酶測(cè)試盒：由南京建成生物工程研究所提供。瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液：由南京建成生物工程研究所提供。葡萄糖、氯化鈉、枸櫞酸鈉、可溶性淀粉、肉湯培養(yǎng)液：由陜西中醫(yī)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室提供。723可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜有限公司生產(chǎn)）、DH6-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海恒科科技有限公司生產(chǎn)）、TDL80-2B型臺(tái)式離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)制造）、HH-2數(shù)顯恒溫水浴箱 （周華電器有限公司）、肝素抗凝管（購(gòu)自南京建成生物工程研究所）、微量式移液器均由陜西中醫(yī)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 可溶性淀粉肉湯的制備

按文獻(xiàn)［2］方法，于肉湯培養(yǎng)液100 mL中加入可溶性淀粉6 g，配制成6%的可溶性淀粉肉湯，混勻后煮沸滅菌備用。

1.5 阿氏液的制備

按文獻(xiàn)［3］方法，葡萄糖6.15 g，枸櫞酸鈉2.4 g，氯化鈉1.26 g加蒸餾水溶解至300 mL。

1.6 雞紅細(xì)胞懸液的制備

按文獻(xiàn)［4］方法，用無(wú)菌注射器自健康雄性雞翼下靜脈采血，按1∶5的量與阿氏液混合，至于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)取備用的雞血用生理鹽水經(jīng)1000 r/min離心5 min，洗滌3次，配制成5%的雞紅細(xì)胞懸液。

1.7 造模及給藥方法

60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組（A組）、脾虛自然恢復(fù)組（B組）、健脾止瀉散大劑量組（C組）、健脾止瀉散中劑量組（D組）、健脾止瀉散小劑量組（E組），各組12只，均雌雄各半（因防止造模過(guò)程中因脫水、意外死亡確保每組動(dòng)物不少于10只，故增加部分動(dòng)物）。

1.7.1 造模 造模前后每日晨定時(shí)觀察大便性狀，測(cè)量飲食量、體重，記錄一般情況。按文獻(xiàn)［5］方法，給B、C、D、E四組小鼠以100%番瀉葉水浸液灌胃，每只0.5 mL/次，每日2次，連續(xù)20 d。據(jù)參考文獻(xiàn)［6］制定本實(shí)驗(yàn)脾虛動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)：（1）泄瀉嚴(yán)重甚至脫肛；（2）食少納呆；（3）消瘦、體重減輕；（4）神態(tài)萎蘼，四肢不收，毛色枯槁；（5）蜷縮聚堆；（6）易疲勞。以（1）、（2）為主證，（3）~（6）為兼證，具備兩項(xiàng)主證及兩項(xiàng)兼證即可認(rèn)為脾虛造模成功。

1.7.2 給藥方法 造模成功后均衡動(dòng)物保證各組間數(shù)量相等，從停止造模當(dāng)日開(kāi)始灌胃，均每只0.5 mL/次，每日2次，共10d。A組：不予處理。B組：0.9%氯化鈉注射液。C組：健脾止瀉散（濃度0.64g/mL，生藥量16g/kg）。D組：健脾止瀉散（濃度0.32 g/mL，生藥量8 g/kg）。E組：健脾止瀉散（濃度0.16 g/mL，生藥量4 g/kg）。

1.8 觀察、檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.8.1 大便性狀、進(jìn)食量和體質(zhì)量 造模前后觀察每只小鼠的大便性狀，記錄進(jìn)食量、體質(zhì)量。并將B、C、D、E四組小鼠與A組進(jìn)行對(duì)照性觀察。（注：為避免檢測(cè)物質(zhì)的周期節(jié)律性變化，上述指標(biāo)的觀察均在8∶00~9∶00進(jìn)行）

1.8.2 腹腔巨噬細(xì)胞的收集 按文獻(xiàn)［2，4，7］方法，略有改進(jìn)，于末次給藥前3 d起每日腹腔注射6%可溶性淀粉肉湯0.5 mL，以刺激小鼠的腹腔產(chǎn)生較多的巨噬細(xì)胞。于末次給藥當(dāng)天下午腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，16 h后處死動(dòng)物，抽取腹腔液，制片，在油鏡下每片觀察100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算出小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

1.8.3 血液的收集和處理 末次給藥當(dāng)日下午禁飲食，12 h后，在抽取腹腔液前摘眼球取血，離心，按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)血清溶菌酶含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠大便性狀，進(jìn)食量、體質(zhì)量的比較 見(jiàn)表1。造模前1周內(nèi)，所有動(dòng)物均反應(yīng)良好，活動(dòng)活躍，大小便、飲食、毛發(fā)均正常，組間無(wú)任何差異。在造模開(kāi)始后第2日起造模組小鼠的大便呈糊狀，第4日起喜扎堆、倦臥，第5日起大便稀薄、肛門(mén)污、背毛散亂無(wú)光澤，第20日，與A組相比，B、C、D、E組小鼠進(jìn)食量和體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01），結(jié)合大便性狀、活動(dòng)、毛發(fā)等的改變，說(shuō)明造模成功。治療后，與B組相比，C、D、E組小鼠的大便性狀逐漸好轉(zhuǎn)，活動(dòng)增多，毛發(fā)有光澤，飲食量和體質(zhì)量明顯增加（P＜0.01），說(shuō)明健脾止瀉散治療本病是有效的。同時(shí)，C、D、E組的飲食量和體質(zhì)量與A組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），且低于A組，說(shuō)明治療組小鼠的飲食量和體質(zhì)量尚未完全恢復(fù)正常，可能與治療療程不足有關(guān)。而C、D、E組間的飲食量和體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明量效關(guān)系不明顯。

表1 造模前后實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量對(duì)照（±s）

表1 造模前后實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量對(duì)照（±s）

與A組比較，*P＜0.01；與B組比較，#P＜0.01，##P＜0.01，###P＜0.01；C、D、E與A組比較，&P＜0.01，&&P＜0.05，&&&P＜0.01。

組 別 時(shí)間 進(jìn)食量（g /只） 體質(zhì)量（g）A組 第1日 3 . 3 1 ± 0 . 3 8 2 0 . 2 4 ± 0 . 8 8（n = 1 0） 第2 0日 4 . 8 5 ± 1 . 1 2 2 5 . 3 1 ± 0 . 9 3第3 0日 5 . 8 3 ± 0 . 5 5 2 8 . 3 0 ± 0 . 8 8 B組 第1日 3 . 3 8 ± 0 . 4 4 2 0 . 2 9 ± 0 . 8 8（n = 1 0） 第2 0日 3 . 2 6 ± 0 . 7 0* 2 0 . 4 6 ± 0 . 4 7*第3 0日 3 . 7 1 ± 0 . 7 0* 2 3 . 4 9 ± 0 . 6 8*C組 第1日 3 . 4 9 ± 0 . 3 7 2 0 . 3 5 ± 0 . 9 0（n = 1 0） 第2 0日 3 . 1 9 ± 0 . 8 1** 2 0 . 9 9 ± 0 . 8 1**第3 0日 4 . 7 8 ± 1 . 2 6#& 2 7 . 2 3 ± 0 . 4 7#&D組 第1日 3 . 4 8 ± 0 . 4 0 2 0 . 5 6 ± 0 . 8 9（n = 1 0） 第2 0日 3 . 3 3 ± 0 . 9 2*** 2 0 . 5 0 ± 0 . 5 2***第3 0日 5 . 0 9 ± 0 . 5 8##&& 2 7 . 7 2 ± 0 . 5 8##&&E組 第1日 3 . 5 1 ± 0 . 3 3 2 0 . 3 9 ± 0 . 6 0（n = 1 0） 第2 0日 3 . 2 3 ± 0 . 7 3**** 2 1 . 0 0 ± 0 . 5 5****第3 0日 4 . 6 8 ± 1 . 0 4###&&& 2 7 . 3 7 ± 0 . 4 5###&&&

2.2 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及血清溶菌酶含量水平的比較 與A組相比，B組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)明顯下降，血清溶菌酶含量明顯降低 （P＜0.01），說(shuō)明脾虛泄瀉存在免疫功能的低下。與B組相比，C、D、E組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)明顯提高，血清溶菌酶含量明顯回升（P＜0.01），說(shuō)明健脾止瀉散提高了機(jī)體的免疫功能，見(jiàn)表2，表3。

表2 健脾止瀉散對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量的影響（±s）

表2 健脾止瀉散對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量的影響（±s）

B組與A組比較，*P＜0.01；C、D、E組與B組比較，#P＜0.01，##*P＜0.01，###*P＜0.01；C、D、E與A比較，&P＜0.01，&&P＜0.01，&&&P＞0.05；C、D、E組間比較，$P＜0.01，$$P＜0.01，$$$P＜0.01。

組別 n 吞噬率（%） 吞噬指數(shù)A組 1 0 5 5 . 3 ± 1 . 1 6 1 . 5 6 ± 0 . 0 6 B組 1 0 2 7 . 1 ± 1 . 6 6* 1 . 1 3 ± 0 . 0 7*C組 1 0 6 9 . 4 ± 1 . 5 1#&$$$$ 2 . 2 1 ± 0 . 1 7#&$$$$D組 1 0 6 3 . 1 ± 2 . 4 2##&&$$ 1 . 7 5 ± 0 . 1 1##&&$$E組 1 0 5 4 . 4 ± 2 . 9 5###&&& 1 . 4 8 ± 0 . 1 2###&&&

由表2可知，E組與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C、D組與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 健脾止瀉散對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清溶菌酶含量水平的影響（±s）

表3 健脾止瀉散對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清溶菌酶含量水平的影響（±s）

B組與A組比較，*P＜0.01；C、D、E組分別與B組比較，#P＜0.01，##P＜0.01，###P＜0.01；C、D、E組分別與A組比較，&P＜0.01，&&P＞0.05，&&&P＜0.01；C、D、E組間比較，$P＜0.01，$$P＜0.01，$$$P＜0.01。

組別 n A組 1 0 B組 1 0 C組 1 0血清溶菌酶（μ g / m L）1 7 . 2 3 ± 5 . 5 6 3 . 7 1 ± 1 . 3 0*2 4 . 6 1 ± 1 . 6 4#&$$$$D組 1 0 1 4 . 5 6 ± 2 . 6 9##&$$E組 1 0 9 . 7 1 ± 2 . 6 4###&&&

由表3可知，D組與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01），C組、E組與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)番瀉葉水浸液灌胃建立脾虛型泄瀉動(dòng)物模型，并用健脾止瀉散治療，觀察小鼠大便性狀、進(jìn)食量、體質(zhì)量、活動(dòng)、毛發(fā)等的變化，檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、血清溶菌酶的含量水平。結(jié)果表明，中藥治療組與脾虛自然恢復(fù)組相比較，小鼠的大便性狀改善、進(jìn)食量、體質(zhì)量增加、活動(dòng)增多、毛發(fā)變得有光澤，同時(shí)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、血清溶菌酶的含量水平明顯提高。因此說(shuō)明，健脾止瀉散具有促進(jìn)機(jī)體消化吸收和提高免疫功能的作用。

本實(shí)驗(yàn)提示脾虛泄瀉小鼠不但有大便性狀改變、飲食量、體質(zhì)量下降等消化功能的障礙，而且巨噬細(xì)胞吞噬功能和血清溶菌酶含量降低，說(shuō)明發(fā)生脾虛泄瀉時(shí)存在機(jī)體免疫功能的低下。通過(guò)健脾止瀉散治療不但明顯改善了實(shí)驗(yàn)小鼠的整體狀況，而且提高了其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和血清溶菌酶含量水平，是從根本上治療小兒脾虛泄瀉的有效方劑。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾”為人體免疫的器官，與免疫功能關(guān)系密切，臟腑功能失常時(shí)免疫力降低，抗病能力下降，導(dǎo)致腹瀉發(fā)生。從而提示脾虛證的本質(zhì)可能是以消化系統(tǒng)功能紊亂為主的全身功能失調(diào)的一種多因素病證。因此，補(bǔ)“脾氣”是治愈該證的治本之法，治療效果與提高機(jī)體的免疫功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用“健脾益氣”的方法，促進(jìn)脾的運(yùn)化功能，改善機(jī)體的各種虛損狀況，使氣血生化有源，機(jī)體的免疫系統(tǒng)可以發(fā)揮其正常的功能，從而有利于疾病趨向痊愈。這與中醫(yī)“脾為之衛(wèi)”、“脾旺不受邪”的認(rèn)識(shí)相符合。通過(guò)健脾止瀉散的使用，一方面可以調(diào)整胃腸運(yùn)動(dòng)，恢復(fù)脾胃的消化吸收功能，改善大便性狀，這是其治療小兒脾虛泄瀉的機(jī)理之一；另一方面，隨著脾胃運(yùn)化功能的好轉(zhuǎn)，消化吸收能力增強(qiáng)，可充分吸收食物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而提高機(jī)體的免疫力。同時(shí)，有些中藥如黨參、白術(shù)、茯苓、薏苡仁本身就具有提高機(jī)體免疫力的作用。隨著免疫功能的提高，小腸吸收能力增強(qiáng)，脾氣健運(yùn)，從而促使腹瀉得到較快恢復(fù)，這是其治療小兒脾虛泄瀉的機(jī)理之二。故健脾止瀉散可通過(guò)健脾補(bǔ)氣增強(qiáng)脾的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。因此，運(yùn)用健脾止瀉散治療脾虛泄瀉是較為科學(xué)的方法。

［1］ 汪受傳.中醫(yī)兒科學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：682.

［2］ 司傳平.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京，人民衛(wèi)生出版社，1999：23.

［3］ 張?zhí)N芬.觀察巨噬細(xì)胞吞噬功能的滴片法［J］.北京醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1979，21（2）：114.

［4］ 周錫順.中藥大棗對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)臨床免疫學(xué)雜志，1992，4（4）：35.

［5］ 劉汶，張郭義.番瀉葉致脾虛證動(dòng)物模型的造模方法［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志，1998，6（4）：231.

［6］ 北京師范大學(xué)生物系消化生理教研組.中醫(yī)脾虛證動(dòng)物模型的造型［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，1980，60（2）：83.

［7］ 章育正.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1996：101.

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1004-745X（2015）02-0278-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.02.033

2014-08-20）