傅里葉變換紅外光譜法鑒別純核桃油并定量檢測摻偽含量

梁鵬娟 趙聲蘭 陳朝銀 葛 鋒 劉迪秋 樊啟猛

（昆明理工大學生命科學與技術學院1，昆明 650500）

（云南中醫學院2，昆明 650500）

傅里葉變換紅外光譜法鑒別純核桃油并定量檢測摻偽含量

梁鵬娟1趙聲蘭2陳朝銀1葛 鋒1劉迪秋1樊啟猛2

（昆明理工大學生命科學與技術學院1，昆明 650500）

（云南中醫學院2，昆明 650500）

應用傅里葉變換紅外光譜（FT—IR）法測定純核桃油和分別混合大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油的摻偽核桃油的紅外光譜，結合主成分分析法（PCA）以及馬氏距離判別法對核桃油的純度進行判別，3個判別模型的準確率均達到100%；同時對驗證集樣品的類歸屬進行判別，判別準確率達均為100%。結合偏最小二乘法（PLS）定量檢測核桃油純度，建立的PLS校正集模型中核桃油的真實含量與FT—IR預測含量的相關系數R2分別為0.990 8、0.994 4和0.995 5，校正集均方根誤差分別為0.032 7、0.023 5和0.019 6。試驗結果證明，該方法可以作為核桃油質量監控的快速檢測方法。

傅里葉變換紅外光譜 核桃油 摻偽 主成分分析—馬氏距離 偏最小二乘法

核桃別名胡桃、羌桃，屬胡桃科胡桃屬植物，是我國重要經濟樹種之一。核桃油是一種營養價值較高的植物油，近年來，其生物活性成分日益引起關注，不飽和脂肪酸總量高達90%左右，其中，亞油酸和ɑ-亞麻酸質量分數分別為47.4%和15.8%，這些不飽和脂肪酸均為人體必需脂肪酸［1］。醫學研究表明：核桃油的多不飽和脂肪酸不僅能使膽固醇酯化，降低血清和肝臟中膽固醇和三酰甘油水平［2-3］，同時含有大腦神經纖維和神經細胞的核心天然成分，促進神經網絡的形成［4］。核桃油不僅具有藥理功效，也可以作為“老人嬰兒營養油”和航空工作人員的保健油，還可以用作化妝品以及護理劑［5］。總之，核桃油的使用價值將會越來越多地受到各界關注。

在國際市場上，核桃油同橄欖油一樣倍受消費者青睞，市場前景廣闊且售價高，然而一些不法經營者將低價位的植物油摻入核桃油中從而牟取暴利。植物油種類不同，脂肪酸組成和營養成分的含量也存在差異，摻假將嚴重影響核桃油的營養功效；更有甚者在植物油中摻入桐油、大麻籽油、蓖麻油、礦物油、潲水油等非食用油，且這些油脂加工處理后與核桃油摻兌，很難通過感官分析和一些理化指標進行區分；不僅損害了消費者的身體健康，而且嚴重地損害了消費者以及合法經營者的利益。因此，迫切需要尋找一種快速可靠的核桃油摻偽檢測方法，有效地遏制這種行為。食用油摻偽作為一個嚴重的問題在商業中存在已久，國內外學者對食用植物油的摻假檢測方法進行了廣泛研究，包括理化方法、色譜法、核磁共振波譜法、紅外光譜法［6-7］。理化方法操作簡便，經濟、易推廣，不需昂貴的儀器，但耗時長，不宜于快速檢驗油脂摻偽工作的開展，且一般都是針對某一種油的特征反應來進行，專一性較強，而且一般只能用來定性不能定量［8］。色譜法和核磁共振法樣品用量少，分析快速，適合大批樣品的檢測，然而該方法所用的儀器較昂貴，操作也復雜，且工作量大、耗時，還需要專門的實驗人員［9-10］。

近年來，傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜逐漸應用到食品研究領域，特別是對于食用油脂的研究已經成為一個強大的分析工具［11］。由于其“指紋技術”，這意味著任何兩個即使只有細微差別的樣品也絕不會具有相同的FT—IR光譜，無論是在峰的數量，或在最大峰值的強度上都會有所體現［12］，此方法的優點在于靈敏度高，速度快、波數準確，重復性好，無需樣品前處理，能夠在線檢測及多組分同時測定等優點。缺點在于特征峰的選取比較困難，各種植物油的光譜圖近似，很難直接區分，需要結合各種化學計量學方法進行數據處理分析。本研究將FT—IR與主成分分析法（PCA）、聚類分析法以及偏最小二乘法（PLS）相結合，鑒別純核桃油以及摻偽核桃油定量檢測，均取得良好的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

純核桃油和選擇的摻偽植物油包括大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油均由原料直接制成。分別將大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油以一定的比例摻入純核桃油中，共配制摻偽樣品63個，見表1。

表1 校正集和驗證集中核桃油摻偽大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油的摻偽比例／%

1.2 光譜采集

采用島津Irprestige-21傅里葉紅外光譜儀，配置DLATGS檢測器以及Irsolution控制軟件。樣品測量時直接將油樣滴在2個KBr芯片中間，形成一層均勻的液膜，放在樣品室（20℃）測定，光譜區域為4 000～400 cm-1，掃描 40次，分辨率 4 cm-1，要求每次掃描前進行背景掃描以去除空氣和濕度的影響。測定每組樣品時均要清洗干凈壓片，先用丙酮清洗2次，再用正己烷清洗2次，最后用脫脂棉擦干，然后進行樣品滴加。光譜采集樣品詳見表1，且另采集20個純核桃油樣品光譜。

1.3 化學計量學分析

化學計量學分析采用SIMCA-P分析軟件，選擇1 500～1 000 cm-1光譜指紋區域的17個波峰波谷值構建模型。采用主成分分析法（PCA）結合馬氏距離判別法鑒別純核桃油以及摻偽核桃油；采用偏最小二乘法（PLS）定量檢測核桃油中摻偽油含量（每種摻偽試驗樣品都包括11個校正集和10個驗證集）。

2 結果與討論

2.1 光譜分析

油脂的主要成分是直鏈高級脂肪酸和甘油生成的酯，具有非常相似的化合物組成，因此，它們混合在一起往往是難以察覺的［13］。紅外光譜能夠用于結構鑒定或通過指紋圖譜對有機基團定性分析，主要由于每個有機化合物都有其特定的紅外吸收光譜；紅外光譜同樣可用于定量分析，以（Lambert-Beer）定律為理論基礎，紅外光譜有許多可供選擇的特征波長，因此，氣體、液體及固體均可利用紅外光譜定量［14］。由于基頻振動是紅外活性振動中吸收最強的振動，絕大多數有機化合物的化學鍵振動基頻均在中紅外區域出現，所以中紅外區最適宜進行各種有機物定性和定量分析。

圖1表示純核桃油、大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油在4 000～650 cm-1區域的平均光譜信息。觀察純核桃油、大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油的紅外光譜，可以發現大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油與純核桃油相比，紅外光譜極其相似，只存在一些細微差別，主要表現在3 007 cm-1處為芳環的C—H伸縮振動，2 854 cm-1處的—CH3對稱和不對稱伸縮振動，1 463 cm-1處的—CH3非對稱彎曲振動，1 377 cm-1的—CH3對稱彎曲振動，1 238 cm-1處的—C—O伸縮振動，1 163 cm-1處是氟原子與芳環直接相接時C—F伸縮振動，1 120 cm-1的—C—O伸縮振動，1 099 cm-1的—C—伸縮振動以及 722 cm-1處的—CH═ CH— 彎曲振動［15-16］。1 500～1 000 cm-1是油脂的紅外指紋區［17］，因此對純核桃油鑒別以及定量檢測大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油在核桃油中的摻偽可以選擇這一光譜區域。

圖1 不同油在4 000～650 cm-1區域的光譜圖

2.2 主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種常用的提取光譜特征信息的方法，也是一種有效的數據降維分析法。利用方差最大原則，通過數學轉換，將原始變量線性組合成一組新的變量，即一組主成分，僅用部分主成分就可表達原有變量的主要信息［18］。利用這一特性，可在減少分析指標的同時，盡量減少原指標包含信息的損失，對所收集的資料作全面的分析。對20個獨立的純核桃油樣品進行紅外光譜掃描，從中選取15張純核桃油的中紅外光譜，并同時對混有大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油的摻偽核桃油進行紅外掃描，每種摻偽油選取11個摻偽比例，在表1中隨機選取。從獲得的光譜中選取波段1 500～1 000 cm-1作為指紋特征光譜分析區域，建立主成分分析模型。

圖2是純核桃油與混有大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油的摻偽核桃油的紅外光譜經過主成分分析后，主成分PC1、PC2、PC3得分的二維散點圖。由圖2可以看出，主成分PC1、PC2、PC3累計貢獻率達到99.9%，幾乎能反映樣本的全部原始光譜信息，純核桃油和3種摻偽核桃油在主成分空間中處于相對獨立的位置，樣本基本得到有效區分，說明純核桃油和不同種類的摻偽核桃油之間存在顯著差異。此外，從圖2可知，混有普洱茶籽油的核桃油與純核桃油相距最遠，混有葵花籽油的核桃油與純核桃油相距最近，混有大豆油的核桃油距離居中。這種分布差異有可能體現了樣本的親緣關系不同，混有葵花籽油的核桃油與純核桃油分布距離最近，化學成分種類最相近。因此，主成分分析模型不僅能區分純核桃油和摻偽油，而且還在一定程度上反映樣本的親緣關系。

圖2 純核桃油與3種摻偽核桃油樣品的主成分得分散點圖

2.3 馬氏距離判別分析

在紅外光譜定性判別分析中，利用測得的光譜來對樣品進行歸屬指定，即判別該樣本是否歸屬某一個總體，這就是差距分析的范圍。馬氏距離判別分析法，從根本上說，就是利用樣本的光譜所提供的最大信息差異或相似性來進行識別［19］。進一步采用主成分分析結合馬氏距離法建立判別模型，可以避免選擇過多波長造成過度擬合，同時保留了光譜的主要信息［20］。

圖3 純核桃油與摻偽核桃油的馬氏距離判別分析模型結果

由主成分分析的結果可知，每一種摻偽油的前2個主成分PC1、PC2的累計貢獻率均已達到98%，本研究選擇前2個主成分來建立模型，以最大限度消除重疊的冗余信息。選取純核桃油15個，其他3種摻偽油中每1種選取11個摻偽濃度建立校正集模型，選取的摻偽樣品與前一步主成分分析時的樣品相同，且表1的其余樣品作為驗證集并進行編號。摻偽大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油的核桃油的判別驗證集的樣品編號分別為 a1～a10、b1～b10和c1～c10，其中a1、b1和c1為表1校正集的1號樣，摻偽油含量為零，即為純核桃油，并另取20個純核桃油中剩余的5個樣品編號為1～5加入驗證集。通過SIMCA—P軟件計算，建立校正集模型，樣品明顯聚為2類，純核桃油和3種摻偽油的判別結果見圖3。

為了進一步確證試驗建立的3個判別分析模型的可靠性，分別用驗證集樣品進行驗證后，均獲得正確分類，分析結果見表2，由表2可知模型的鑒別效果很好，判別率為100%。

表2 模型對驗證集樣品的預測結果

2.4 偏最小二乘法分析

偏最小二乘法（partial least square，PLS）是一種應用非常廣泛的化學計量學方法，它綜合了多元線性回歸法（MLR）和主成分回歸法（PCR）的優勢，在一個算法下可以同時實現回歸建模、數據結構簡化以及兩組變量之間的相關分析［21］。預測大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油在核桃油中的摻偽量，首先建立校正集模型，依然選取指紋區1 500～1 000 cm-1的光譜區域，并利用相關系數R2，均方根誤差（RMSEC）和交互驗證均方根誤差（RESECV）值來確定最佳主因子數，R2值越高，RMSEC和RESECV值越小得到的最佳主因子數，說明模型的預測能力越好［22］。

2.4.1 校正集模型的建立與優化

通過SIMCA—P軟件對核桃油中混合大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油3種摻偽油品建立校正集，模型的相關系數分別為：0.990 8、0.994 4、0.995 5，校正集均方根誤差（RMSEC）分別為0.032 7、0.023 5和0.019 6。優化PLS模型采用交叉驗證的“除一法”技術，在這項技術中，校正集中的一組樣品被剔除，接著用剩余樣本建立的模型來預測，并重復該步驟，直到每組樣品從模型中被排除1次［23］。則計算3種摻偽油品的交叉驗證均方根誤差（RMSECV）分別為0.035 2、0.026 9和0.022 5，在此結果的基礎上，再結合較高的R2和較低的RMSEC值，確定了3種摻偽油校正集模型的最佳主因子數分別為6、5和5，且進一步證明模型預測性良好。

2.4.2 預測集樣品對模型的檢驗

圖4 校正集模型對混合不同油脂的摻偽油驗證集中核桃油含量的預測

圖4表示核桃油的真實百分比與FT—IR估計百分比的PLS校正集模型對驗證集的預測。即用建立的校正集對混合大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油的摻偽油進行核桃油含量的預測，驗證相關系數分別 為0.9861、0.9912和0.9930，R2值均較高；驗證集均方根誤差（RMSEP）分別為0.047 3、0.034 9和0.028 1，均較低；有以上2點可知試驗所建立的PLS校正集模型非常成功，證明FT—IR結合PLS能夠準確地對核桃油摻偽含量進行檢測。表3包含了所有PLS模型的 R2、RMSECV、RMSEC、RMSEP值，以及建立模型的主因子數。

表3 核桃油摻偽大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油的PLS模型的相關結果

3 結論

選擇大豆油、普洱茶籽油和葵花籽油作為摻偽植物油混入核桃油中，采用FT—IR光譜技術結合PCA和馬氏距離判別法能快速鑒別純核桃油和摻偽核桃油，結合PLS能夠準確檢測出核桃油的摻偽水平，為核桃油質量的控制和檢測提供了一種新的簡便方法。

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The Application of Fourier Transform Infrared（FT-IR）Spectroscopy for Detection and Quantification of Adulteration in Pure Walnut Oil

Liang Pengjuan1Zhao Shenglan2Chen Chaoyin1Ge Feng1Liu Diqiu1Fan Qimeng2
（School of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology1，Kunming 650500）
（Yunnan University of Chinese Traditional Medicine2，Kunming 650500）

Fourier transform infrared（FT-IR）spectrometer was used to collect infrared spectra of pure virgin walnut oil（VWO）and VWOs adulterated with soybean oil（SO），pure tea seed oil（PO）and sunflower oil（SFO）.FT-IR spectroscopy combined with principal component analysis（PCA）and mahalanobis distance were developed for determining the authenticity of VWO，and all the accuracy rates of three models are 100%；Meanwhile，validation samples were used to predict the results by the models，and all the prediction accuracy rates are 100%.The partial least square（PLS）model was further used to predict the levels of these vegetable oils in independent samples for validation purpose.PLS models correlate the actual and FT-IR estimated values of oil adulterants（SO，PO and SFO）with coefficient of determination（R2）of 0.990 8，0.994 4，0.995 5 respectively.The RMSECvalues of SO，PO and SFOin VWOobtained are 0.032 7，0.023 5 and 0.019 6，respectively.The method，therefore，has been as a rapid method for detection and quantification of VWO adulteration.

FT-IR spectroscopy，pure walnut oil，adulteration，principal component analysis-mahalanobis distance，partial least squares

TS227

A

1003-0174（2015）02-0122-06

國家科技支撐計劃 （2011BAD46B03），云南省科技計劃 （2009EB081，2011AB006）

2013-09-29

梁鵬娟，女，1988年出生，碩士，生物化工

陳朝銀，男，1957年出生，教授，生物資源高效利用