致動脈粥樣硬化過程中不同表型的巨噬細胞對泡沫細胞形成的影響及機制

尚茹茹，劉曉紅，張 錦，袁 鋒，溫 婷

致動脈粥樣硬化過程中不同表型的巨噬細胞對泡沫細胞形成的影響及機制

尚茹茹1，劉曉紅2，張 錦2，袁 鋒3，溫 婷3

目的 探討致動脈粥樣硬化過程中不同表型的巨噬細胞對泡沫細胞形成的影響及機制。方法 提取C57BL/6小鼠骨髓單核細胞誘導分化為巨噬細胞，分別給予干擾素γ(IFN-γ)、內毒素(LPS)、白細胞介素4(IL-4)刺激分化為M1和M2型巨噬細胞，加入氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)孵育48 h。高效液相色譜法(HPLC)檢測細胞內的總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)及膽固醇酯(CE)的含量。行RT-PCR及Westernblot檢測巨噬細胞清道夫受體CD36及SR-A1在mRNA和蛋白水平的表達；行Westernblot檢測內質網應激(ERS)的標志性分子糖調節蛋白78 ( GRP78)和GRP94的表達。結果 M1型巨噬細胞組油紅O染色陽性細胞較M2型巨噬細胞組少，M1型巨噬細胞內TC、FC及CE的含量較M2型巨噬細胞低(P<0．05)。清道夫受體CD36及SR-A1在M2型巨噬細胞的表達高于M1型巨噬細胞，內質網應激的標志性分子糖調節蛋白78和糖調節蛋白94的表達在M2型巨噬細胞高于M1型巨噬細胞。結論 在ox-LDL刺激下M2型巨噬細胞較M1型巨噬細胞更易形成泡沫細胞，其機制可能是由于內質網應激增加了清道夫受體CD36及SR-A1在M2型巨噬細胞的表達，促進了M2型巨噬細胞對ox-LDL的吞噬。

動脈粥樣硬化；巨噬細胞； 泡沫細胞； 表型

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎。單核/巨噬細胞在動脈粥樣硬化的病理過程中發揮著重要作用[1]。在體內外不同微環境影響下巨噬細胞可分化為M1型(經典活化型)和M2型(替代活化型)，在干擾素γ(IFN-γ)加內毒素(LPS)誘導下可分化為M1型，分泌大量的IL-12、IL-23及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細胞因子，參與炎癥反應、病原體的清除及活性氧的表達，具有促AS作用；在IL-4誘導下分化為M2型，IL-10及精氨酸酶等的分泌和表達增多，有抑炎及促損傷修復的作用[2，3]。巨噬細胞通過清道夫受體途徑吞噬氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化的重要環節[4]。近年來研究發現內質網應激通過上調清道夫受體CD36的表達促進了巨噬細胞源性泡沫細胞而形成，參與了AS的啟動和進展[5]。那么經誘導分化形成的M1/M2型巨噬細胞吞噬脂質能力是否有所不同，這一差別是否與內質網應激調控的清道夫受體的表達有關需要進一步研究。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 C57BL/6小鼠購自山西醫科大學動物中心；巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、IL-4、LPS、IFN-γ；ox-LDL(北京協生生物有限公司)；RT-PCR試劑盒(FERMENTA公司)；cDNA合成試劑盒和Real Master Mix(SYBR Green )試劑盒(Takara，日本)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)；兔抗CD36、SR-A1、GRP78和GRP94多克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1．2細胞培養及分組 據文獻方法[6]，將分化的巨噬細胞按1×108個/L的密度種入6孔板內，分成3組：空白對照組、IFN-γ+LPS處理組、IL-4處理組。IFN-γ+LPS處理組加入20 ng/mL IFN-γ和LPS100 ng/L分化成M1型巨噬細胞，IL-4處理組加入20 ng/mL-4分化成M2型巨噬細胞，孵育24 h。然后，在IFN-γ+LPS組、IL-4組中分別加入40 ng/mL ox-LDL孵育48 h，空白組不行任何處理。實驗組每組設3個復孔。

1．3 行油紅O染色觀察 M1/M2型細胞內脂質的聚集情況：將細胞培養在放有無菌蓋玻片的6孔板內，處理結束后用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗1次，再用丙二醇固定5 min，棄丙二醇，加入0．5%油紅O的丙二醇溶液，置60℃烤箱中染色15 min，用85%丙二醇沖洗5 min，再用PBS 洗3次，蒸餾水洗1次，蘇木素復染2 min～5 min，1%HCl分色及返藍后

封片，顯微鏡下觀察到：脂滴染成紅色，細胞核染成藍色。

1．4 細胞內膽固醇含量測定[7]處理結束后棄上清PBS洗3次，用細胞刮刀刮取細胞置于離心管中，反復凍融，冰浴中超聲裂解細胞。用于提取總膽固醇和游離膽固醇。膽固醇用外標法峰面積定量細胞蛋白。

1．5 RT-PCR檢測CD36和SR-A1 按Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA。取2 μg RNA逆轉錄合成cDNA產物。按RT-PCR試劑盒說明書準備20 μ gPCR擴增反應體系，以β-actin為內參，利用2-△△Ct公式計算目的基因的表達情況。

1．6 Western blot檢測CD36、SR-A1、GRP78和GRP94的表達 處理結束后收集細胞并裂解后移至一個新EP管中，用BCA法測蛋白濃度。然后配置8% SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，結束后轉至硝酸纖維素膜(NC)膜上，根據Marker的位置裁剪所需的目的蛋白、內參條帶對應的膜，5%脫脂奶粉封閉后分別用兔抗鼠CD36(1∶400)、SR-A1 (1∶300)、GRP78 (1∶400)、GRP94抗體(1∶200)和抗β-actin抗體(1∶5 000)，4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。用Odyssey分析蛋白的表達。

2 結 果

2．1 油紅O染色結果 空白對照(MO)無油紅O，M2型巨噬細胞內油紅O較M1型巨噬細胞多。

2．2 HPLC法檢測泡沫細胞內膽固醇含量 M2型巨噬細胞內TC、FC 和CE的含量高于M1型巨噬細胞。詳見表1。

表1 M1/M2型巨噬細胞內膽固醇含量

2．3 M1/M2型巨噬細胞源性泡沫細胞CD36、SR-A1、GRP78和GRP94的表達 M2型巨噬細胞在mRNA水平和蛋白水平上，CD36和SR-A1的表達均高于M1型巨噬細胞；M1型巨噬細胞在蛋白水平GRP78和GRP94的表達低于M2型巨噬細胞。詳見表1、表2、圖1。

指標M1M2PCD360.90±0.132.57±0.570.01SR-A11.24±0.272.57±0.740.04

圖1 M1和M2型巨噬細胞CD36、SR-A1、GRP94及GRP78在蛋白水平的表達

3 討 論

本實驗用ox-LDL誘導M1型和M2型巨噬細胞泡沫化，行油紅O染色示M2型巨噬細胞內的油紅O較M1型巨噬細胞多。行HPLC法檢測細胞內脂質含量發現M2型巨噬細胞內的TC、FC 和CE均高于M1型巨噬細胞。清道夫受體(主要是CD36和SR-A1)介導的ox-LDL無限制攝取是泡沫細胞形成和AS發生發展的重要環節[8]，推測M2型巨噬細胞吞入膽固醇含量較M1型巨噬細胞吞入膽固醇含量多的原因可能是：M2型巨噬細胞表達的清道夫受體CD36和SR-A1較M1型多。用RT-PCR和Western blot檢測發現：M2型巨噬細胞在mRNA水平和蛋白水平上，CD36和SR-A1的表達均高于M1型巨噬細胞。

內質網是調控蛋白質和鈣穩態的重要細胞器，主要調控細胞內蛋白的合成、折疊、修飾和運輸以及鈣穩態。氧化應激、膽固醇超負荷、鈣穩態失衡等理化環境變化均可導致內質網功能紊亂，出現以未折疊/錯誤折疊蛋白聚集和鈣穩態失衡為主要特征的內質網應激反應[9]。內質網功能紊亂首先導致蛋白質的合成和運輸障礙，造成大量未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網中堆積，后者稱為未折疊蛋白反應(UPR)。GRP78、GRP94及蛋白激酶樣內質網激酶( PERK)等上調均為內質網應激發生的標志。ERS誘導劑衣霉素可上調巨噬細胞清道夫受體 CD36表達水平[10]。內質網應激和未折疊蛋白反應能誘導清道夫受體CD36和SR-A1的表達[11]。行Western blot檢測經過ox-LDL刺激后M2型巨噬細胞GRP78和GRP94的表達高于在M1型巨噬細胞。推測M2型巨噬細胞較M1型巨噬細胞更易形成泡沫細胞，可能是ox-LDL作用后M2型巨噬細胞更易發生ESR，促使清道夫受體CD36和SR-A1在M2型上的表達增高，增加了對ox-LDL的攝入。

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(本文編輯 王雅潔)

山西省科學技術廳項目(No．2014011043-5)

1．山西醫科大學第一臨床醫院(太原 030001)；2．山西省人民醫院；3．山西醫科大學

劉曉紅，E-mail： docliuxh@163．com

R540 R285

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．11．009

1672-1349(2015)11-1273-03

2015-02-09)