基于微創光纖探頭的熒光檢測系統設計

陸想想，錢志余，李韙韜，湯飛飛

（南京航空航天大學 生物醫學工程系，江蘇 南京 210016）

越來越多的研究領域需要檢測生物組織的熒光強度變化[1]。用于熒光檢測的儀器有熒光分光光度計、CCD相機、光纖光譜儀等。熒光分光光度計具有非常高的精密度，對微弱信號有著較好的適應性，但只能應用于離體檢測[2]。CCD相機能夠觀測到生物體整體的熒光強度分布情況，且有比較高的分辨率，但是不便于進行連續長時間的在體熒光檢測[3]。光纖光譜儀雖然可以通過光纖，實現在體檢測，但是檢測靈敏度有限[4－5]。

本文提出采用高靈敏度的光電倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）作為核心探測器[6]，使用高速數據采集卡進行數據采集，采用虛擬儀器技術，以Labview為信息處理平臺，設計采集系統軟件。同時設計了適用于在體檢測的微創光纖探頭，探頭可直接深入生物組織。光纖探頭的頂端安裝有聚焦透鏡，將光聚焦到光纖中可以提高微弱信號的檢測效率。光纖探頭獲得的光信號通過光電檢測系統處理，轉換為電信號，進過數據采集卡進入上位機后可實時顯示熒光強度的變化。

1 光電檢測系統設計

1.1 系統總體結構

系統由光電探測模塊、PMT分壓與外部供電模塊、信號預處理模塊和上位機信號實時動態顯示等部分組成。

圖1 熒光檢測系統結構框圖Fig.1 Structure diagram of the fluorescence detection system

為了滿足生物組織內部熒光信號的探測，采用微創光纖探頭深入組織發光部位，采集微弱熒光信號。所用的光纖為春暉科技公司生產的石英光纖，有效工作波長200～1200 nm，根據實際探測需要，可給探頭裝配聚焦透鏡，達到匯聚微弱熒光的作用，提高信號的檢測效率。

生物組織的熒光信號比較微弱，在檢測過程中容易受到背景噪聲的干擾，將待檢測的有用信號完全淹沒在噪聲中。為光電倍增管設計了金屬屏蔽罩。金屬屏蔽罩有兩點重要的作用，一是可以屏蔽背景雜光，二是電磁屏蔽，防止信號處理電路產生的電磁波對光電倍增管的影響。屏蔽罩需要接地。在光電倍增管與光纖的入射窗之間加入適當的濾光片，保證只有特定波段的光通過。

1.2 PMT分壓與供電電路設計

由一系列電阻構成分壓器提供PMT各倍增極之間的電壓，如圖2所示。

在理想情況下，分壓器回路各個倍增級之間的電壓是均等的，流過各級分壓電阻的電流IR為：

式中UH是負高壓，Ri是分壓電阻，流過各個倍增極分壓電阻上的電流并不是相等的，陽極電流Ia最大，該電阻上的壓降也最大，產生電壓重分配效應，導致各個倍增極的分壓隨陽極電流的變化而變化，從而使PMT的增益發生改變。但是，當流過分壓電阻的電流IR遠大于Ia時，流過各個分壓電阻IR的電流可以認為近似相等。因此，分壓電阻阻值的選取應盡量小。

另一方面，分壓電阻阻值越小，電阻功率損耗越大，越容易產生熱效應，導致PMT溫度升高、性能降低。綜上，需要折衷考慮電阻的取值，本系統設計選用390 kΩ的電阻。當入射信號為快速變化的信號或脈沖信號時，會引起最后三級倍增極電流的劇烈變化，破壞PMT增益的穩定性。末三極分別并聯一個電容，通過電容的充放電，使末三級電壓保持相對穩定。

系統使用的高壓供電模塊是北京濱松光子公司的產品，型號為 CC228－01Y，輸入電壓 12 V，輸出電壓 0～－1250 V。通過控制電阻的調節，可以給PMT提供千伏以上的負高壓。

1.3 轉換電路設計

PMT的輸出信號是電流信號，但是后續電路是基于電壓信號而設計的，因此，首先需把電流信號轉換為電壓信號。通過串聯一個負載電阻，實現信號的轉換。如圖3所示。

PMT 輸出電流范圍為 10－10～10－3A，近似當作恒流源。 如果負載電阻過大，將導致輸出線性和頻率響應的惡化。信號輸出的截止頻率fC為：

圖3 電流－電壓轉換電路Fig.3 Current-voltage conversion circuit

式中RL是負載電阻，CS是負載電阻PMT陽極和其他電極之間的靜電電容量，以及由于布線等引起的雜散電容量的總和。由上式可以看出，雖然PMT和放大器響應時間極快，輸出響應也會受到截止頻率的限制。如果負載電阻RL過大，在高輸出電流的情況下，負載電阻RL將導致陽極電壓降增大，導致陽極與末級倍增極電壓降低，破壞輸出線性性。負載電阻應采用溫度系數較小的金屬膜電阻，以減小溫度漂移對測量結果的影響。PMT的信號輸出部分選用低噪聲同軸電纜線，降低噪聲對關鍵信號的影響。

1.4 信號濾波與放大電路設計

經負載電阻RL后輸出的電壓信號為毫伏級別甚至更低，同時混有各種干擾信號，需要濾波處理并進一步放大，以滿足后續數據采集的要求。運算放大器選擇零點偏移小，無外部調零的器件。同時輸入阻抗和開環放大倍數無窮大，保證輸入端工作電流為0；輸出阻抗無窮小，保證輸出電壓不隨下級負載而變。系統選用TI公司的TLC272放大器芯片，該芯片的特點是低噪聲、低失調電壓、高輸入阻抗，高響應速度，適用于微弱信號放大的場合。

圖4 信號放大及倍率選擇電路Fig.4 Amplifying and ratio selection circuit

系統設計了一個換擋開關，分4個倍率檔位，以適應不同強度的熒光信號。每個檔位分別由一個電阻和一個電容構成，放大倍數由電阻值決定。電容起積分作用，抑制或平滑高頻噪聲。電容值越大，抗干擾能力越強，但是會犧牲系統的響應速度，因此需要根據系統的需求，合理地選取C1～C4的值。

2 數據采集系統設計

本文采用美國國家儀器公司，型號為PCI－6251的數據采集卡進行數據采集。以Labview為平臺構建虛擬儀器。實時監測信號特征。系統的信號變化范圍為0～10 V。本文用于數據采集的子VI主要有：

DAQmx Create Channel.VI，創建虛擬通道，配置接線端的接線模式，設定輸入的范圍等。本文接線端采用差分輸入模式，設定的輸入范圍為－0.1～10 V。差分輸入模式有利于消除信號在傳輸過程中受到的大部分環境干擾。

DAQmx Timing.VI，設置采樣時鐘源以及時鐘頻率等信息。本文設定的采樣模式是連續采樣模式，每通道采樣數參與定義循環緩沖的大小。數據的讀取速度有限，可以適當增加每通道采樣數以增大緩存，防止數據溢出。

DAQmx Read.VI，從指定的虛擬通道讀取數據，讀入的數據為熒光光強轉換得到的電壓值，模擬信號以波形的方式直觀地顯示。信號不可避免地會受到50 Hz工頻干擾，以及其他系統高頻干擾，因此有必要設置低通濾波器，截止頻率為5 Hz。

設計的數據采集系統儀器面板如圖5所示。儀器面板的左下部分為系統配置窗口，在開始采集之前首先進行通道設置，選擇數據采集卡任一可用的模擬輸入通道，然后設置采樣率，每通道采樣數以及采樣模式等。啟動程序，通過右側部分的窗口對數據進行實時觀測，上半部分是原始采樣得到的數據，下半部分是濾除高頻噪聲后得到的比較穩定的數據，同時也可以在左下部分的窗口讀取實時的電壓值。或者將采樣得到的數據寫入測量文件，進行進一步的處理和分析。

圖5 熒光強度檢測系統儀器面板Fig.5 Instrument panel of the fluorescence intensity detection system

3 熒光檢測實驗結果與討論

3.1 實驗方法

選用已消毒的大白鼠，實驗前禁食過夜但可自由飲水。實驗前腹腔注射20%的烏來糖1 mL麻醉，剪去大鼠右側腿部白毛，酒精消毒，找到股動脈分叉處，切開1 cm左右的小口露出股動脈。在自制支架上用繩索固定大鼠4只腿，調節光纖端口位置使與股動脈垂直并緊貼股動脈分叉處，然后固定。光源光纖端口平行對準大鼠腿部的另一側，固定后打開激光光源。用5 mL注射器抽取2 mL 20%DMSO生理鹽水配置的濃度為250μg/mL的CYPATE，通過大鼠尾靜脈注射給藥。給藥后立即開始記錄數據，每1 min記錄一次熒光強度數據，記錄到30 min時開始每5 min記錄保存一次數據。整個操作過程除進行靜脈注射其余全部在暗室中進行。

同樣選用已消毒的大白鼠進行系統的評估實驗。尾靜脈注射2 mL濃度為 250μg/mL的 CYPATE，給藥后分別于1，5，10，15，20，30，60，90 min 從眼眶取血 0.6 mL，4 000 rpm離心10 min后取血漿，置于2 mL EP管中于冰箱中保存。取完所有時間點后將每組裝有血漿的EP管并排放置在CCD照相機下進行成像。熒光成像圖如圖6，1～8分別表示給藥后1，5，10，15，20，30，60，90 min 得到的血漿熒光成像。

圖6 不同時間點的血漿在近紅外成像系統中的熒光成像圖Fig.6 Plasma at different time points ofthe near-infrared imaging fluorescence imaging system

3.2 實驗結果與討論

與將設計的熒光檢測系統在體監測的結果，經歸一化后，與經過同樣方式數據處理的體外監測結果進行比較，結果如圖7所示。

圖7 熒光檢測系統和近紅外成像系統檢測結果比較Fig.7 Comparison of the detection results of fluorescence detection system and near-infrared imaging system

對比結果可以看出，這兩種方法測得的時量曲線的下降幅度稍有不同，體外熒光檢測顯示靜脈注射CYPATE 5 min后曲線下降幅度要略微大于在體監測得到的結果，這可能是由于血管中的CYPATE在5 min后向周圍組織擴散，而股動脈相對較細，在體監測的接收光纖口不但接收了血管中的熒光強度，同時也接收了周邊組織中散射過來的熒光，結果導致在體監測血管中的熒光強度要大于實際血流中的熒光強度，但是通過時量曲線的比較也可以看出這種影響的程度不大。

在持續工作的90 min內，熒光檢測系統的檢測結果，與現有成像系統的結果的變化趨勢保持一致，證明本文設計的系統是有效的。60 min以后的曲線依然非常穩定，表明系統能夠在較長時間內保持穩定的工作狀態，滿足在體熒光檢測的要求。

為了將本設計運用于更微弱的熒光檢測場合，還需要進一步改進檢測電路，改進光纖探頭的設計，提高檢測靈敏度。本系統為后續的研究提供了有利條件。本文研究的微創光纖探頭不僅可以作為熒光探測器，也可以作為激發信號的導入載體。因此，基于微創光纖探頭的內窺式熒光檢測系統設計，對于在體醫療器械的研究和開發，具有重要的價值。

4 結 論

本文以光電倍增管為核心探測器，使用高速數據采集卡進行數據采集，采用虛擬儀器技術，以Labview為信息處理平臺，設計了基于微創光纖探頭的內窺式熒光檢測系統。該系統可實時反映生物組織或離體組織的熒光強度變化。通過在體實驗驗證，以及現有的熒光成像系統體外實驗評估，可以初步認定，本文設計的熒光檢測系統對于生物組織的熒光檢測有著較高的靈敏度和精確度，并且能夠完成在體的連續測量。

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