抑制自嗜增強Salirasib誘導的骨肉瘤細胞凋亡

王進軍 劉建民 梁勇

Ras超家族是一類重要的功能蛋白。它們介導生長因子、細胞因子和多種細胞外信號的信息通路，對細胞生長、分化、存活、增殖等有重要作用。Ras通路的激活與人類很多腫瘤的發生、發展有關，超過33%的腫瘤伴有Ras亞型（H，K，N）的突變[1]，因此，Ras蛋白常被作為腫瘤治療的靶向。Salirasib（FTS）是一種合成的Ras抑制劑，它能阻止Ras蛋白固著于膜上，降低了細胞中Ras的水平，進而抑制了Ras依賴的細胞生長[2]。

自嗜，是細胞成分的自我消化過程，能夠維持蛋白合成及降解之間的平衡。自嗜對細胞的正常生長很重要。細胞在遭遇諸如缺氧、化療或放療等應激時，會啟動賴以生存的自嗜。

通過自嗜，細胞可以清除降解胞內受損的細胞結構、衰老的細胞器以及不再需要的生物大分子等[3]。在消化的同時，自嗜也為細胞內細胞器的重新構建提供了原料，即細胞結構的再循環。因此，作為應激狀態下啟動的生存機制，自嗜對細胞的存活起著關鍵作用。研究表明，自嗜參與了諸如胰腺癌、乳腺癌和肝癌等腫瘤疾病的進程。然而，關于自噬在促進生存和誘導死亡之間變化的具體分子機制尚不完全明確，可能與細胞代謝失衡有關[4]。氯喹通常作為抗瘧疾藥使用，研究顯示，氯喹可以通過阻止自嗜體與溶酶體的結合而終止自嗜[5]。

近年研究顯示，抑制自嗜可以作為腫瘤治療的一種新方法[6]。本研究中們檢測了氯喹聯合FTS對細胞活性的影響。結果顯示，單獨FTS能誘導人骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的發生，并對細胞的生長起抑制作用。氯喹抑制自嗜后，能增強FTS對細胞的生長抑制及誘導Caspase-3依賴的細胞凋亡。本研究表明，聯合治療較單藥效果更為突出。

1 資料與方法

1.1 細胞系來源 人骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS購于中科院典藏細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 FTS和CQ購自Sigma-Aldrich，Anti-actin 購自MP Biomedicals,Anti-caspase 3和Antisurvivin 購自 Santa Cruz，Anti-LC 3 購自 Sigma-Aldrich。

1.2.2 主要儀器 流式細胞儀（FCM，Becton Dickinson）、倒置相差顯微鏡(O L Y M P U S,I X 70-S 8F)、超凈臺(HERAEUS,HFSafe 1200)、CO2培養箱(HERAEUS)、恒溫培養箱(Thermo Inc)、超純水裝置(MILLIPORE)、小型臺式離心機(SIGMA)、電子天平(TC 32 A)、低溫冰箱(Sanyo)、高速離心機(Biofμge HERAEUS)、核酸蛋白定量分光光度計（GeneQuant，美國Amersham公司）Western電泳設備（Bio-Rad）、熒光定量PCR 儀（ABI Prism 7000）、瓊脂糖膠電泳儀（Bio-Rad）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 細胞用10%胎牛血清的DMEM培養液培養，放置在37℃，5%CO2孵箱中。測細胞活性時，將其與等量0.4%的臺盼藍溶液混合，然后在顯微鏡下觀察。

1.3.2 細胞質、細胞核提取物的制備 通過CelLytic TM和NuCLEAR TM試劑盒制備細胞提取物。先用無菌的PBS水洗滌細胞，吸凈PBS，將含有蛋白酶抑制劑的裂解液均勻滴在細胞上，放在冰上15 min后，用刮匙將細胞從培養皿刮下，收集混合液。然后高速離心15 min，收集上清液，于-20℃儲存。通過蛋白定量分析評估蛋白濃度，所得提取物用于Western blot分析。

1.3.3 Western印跡 制備12%的SDS-PAGE電泳凝膠后，將蛋白裂解液每個泳道上蛋白樣20 μg。然后，以80 V，90 min分離蛋白。之后，恒壓120 v進行轉膜，持續90 min。將PVDF膜于牛奶中封閉1 h，然后加入一抗結合PVDF膜，于4℃孵育過夜。第2天，將膜在室溫下搖1 h，然后孵育二抗，1 h后用PBST洗膜3次。之后，通過標準增強化學發光發檢測標記信號。

1.3.4 Sub-G 1期的檢測 用無菌的PBS將經過藥物處理的細胞清洗2遍，于0.1% Triton X-100環境孵育10 min，再次洗滌，之后再于25 mg/mL的碘化丙啶及1 μg/mL的RNase A中孵育15 min。通過FACScan流式細胞計數分析細胞熒光，檢測細胞Sub-G 1期。

1.4 統計學方法 應用SPSS 10.1軟件進行統計學分析。正態計量資料采用“±s”表示；2組正態計量數據的組間比較采用t檢驗；計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FTS誘導骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的發生為了確定FTS能否誘導骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的發生，Western檢測了LC 3-II蛋白的表達水平。LC 3-II蛋白是自嗜發生的標志蛋白。用不同特定濃度的FTS處理細胞一定時間，Western檢測LC 3-II蛋白的表達。結果顯示，FTS在兩個細胞系中均誘導了自嗜的發生，且呈劑量依賴關系。見圖1。

圖1 FTS誘導骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS中 LC 3-II蛋白的表達

2.2 氯喹對FTS誘導骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的影響 確定了FTS可以誘導骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS發生自嗜后，進一步檢測氯喹對 LC 3-II蛋白表達水平的影響。氯喹能通過抑制自嗜體和溶酶體的融合而抑制自嗜過程的進展，因此會導致細胞內 LC 3-II蛋白的積累。用特定濃度的FTS單藥或者聯合氯喹處理細胞。結果顯示，氯喹處理能明顯增加FTS誘導的 LC 3-II蛋白的積累。與單獨FTS處理相比，聯合治療明顯增強了 LC 3-II蛋白的水平。見圖2。

圖2 氯喹增強了骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS中FTS誘導的自嗜

2.3 FTS聯合氯喹對細胞活性的影響 檢測單獨FTS及聯合氯喹治療對細胞活性的影響。分別用60um和50um的FTS單獨或聯合氯喹（4uM）處理骨肉瘤細胞系MG63和U2-OS一定時間。臺盼藍實驗檢測細胞活性。如圖3A和B所示，單獨FTS治療已明顯抑制了細胞的生長。在聯合氯喹的情況下，FTS的效果更加明顯。該結果表明，FTS可以抑制細胞生長，但其誘導的自嗜可能部分保護細胞，氯喹抑制自嗜可以增強細胞對藥物的敏感性。

圖3 氯喹增強骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS中FTS誘導的細胞生長抑制

2.4 FTS聯合氯喹對細胞凋亡的影響 流式細胞技術檢測聯合治療對細胞凋亡的影響。結果顯示，在2個細胞系中，氯喹均增強了FTS誘導的細胞凋亡。圖4顯示，與單獨治療組相比，聯合治療使處于Sub-G 1期的細胞數明顯增多。因此，氯喹促進了FTS誘導的細胞凋亡。

圖4 與單獨治療組相比，聯合治療使處于Sub-G 1期的細胞數明顯增多

2.5 FTS聯合氯喹誘導細胞凋亡的機制 為了進一步闡明FTS聯合氯喹誘導細胞凋亡的機制，檢測了經處理后細胞系中兩種重要凋亡蛋白的表達：caspase-3和survivin。結果顯示，聯合治療明顯增強了Caspase-3的水平，減弱了survivin的表達。見圖5。因此，FTS聯合氯喹誘導了兩種細胞系中依賴Caspase-3的凋亡。

圖5 與單獨治療組相比，聯合治療明顯誘導了兩種細胞系中依賴caspase-3的凋亡

3 討論

本研究顯示，FTS能誘導骨肉瘤細胞系MG 63和U 2-OS中自嗜的發生，并對細胞的生長起抑制作用。氯喹抑制自嗜后，能顯著增強FTS對細胞的生長抑制及Caspase-3依賴的細胞凋亡。

Ras通路是許多信號通路的交匯點，對細胞活性起著調控作用[7]。作為一種Ras抑制劑，FTS能阻止Ras蛋白固著于膜上，降低了細胞中Ras的水平，進而抑制了Ras依賴的細胞生長。然而，FTS在抑制細胞生長的同時，也誘導了自嗜的發生。自嗜是一種進化高度保守的過程，是細胞內的防御和應激調控機制[8]。通過自嗜，細胞可以消除和降解受損、變性、衰老及失去功能的細胞器、變性蛋白質及核酸大分子等，以維持細胞內環境的穩態。有文獻認為，自嗜的發生有助于促進細胞的存活，但也有文獻表明，過度自嗜將誘導細胞凋亡[9]。還有研究表明，自嗜不僅有抑癌作用，在腫瘤的形成過程中自嗜也起作用[10]。

先前有研究表明，FTS誘導的自嗜在一定程度上對細胞起保護作用，該結果提示我們可以研究FTS聯合自嗜抑制劑對腫瘤細胞活性的影響。多年來，氯喹在臨床上一直被用于瘧疾的治療，其藥效安全，是理想的自嗜抑制劑。一些研究報道，氯喹還具有抗腫瘤的良好效果。總之，本研究表明FTS除了能抑制細胞生長外，還能誘導保護性的自嗜并激活凋亡通路，氯喹抑制自嗜將增強FTS誘導的凋亡，這為腫瘤治療提供了一種新的途徑。

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