微分干涉差顯微成像方法高通量分析單個蘇金云芽孢桿菌HD-1芽孢萌發

陳越彭立新王曉春黎永青劉軍賢王桂文（廣西師范大學物理科學與技術學院,桂林54004）（廣西科學院生物物理實驗室,南寧50007）（美國東卡羅來那大學物理系,美國北卡羅來那州格林維爾NC7858）

研究報告

微分干涉差顯微成像方法高通量分析單個蘇金云芽孢桿菌HD-1芽孢萌發

陳越1,2彭立新2王曉春2黎永青3劉軍賢*1王桂文*21（廣西師范大學物理科學與技術學院,桂林541004）2（廣西科學院生物物理實驗室,南寧530007）
3（美國東卡羅來那大學物理系,美國北卡羅來那州格林維爾NC27858）

蘇云金芽孢桿菌（Bt）休眠的芽孢具有極強的抗逆境能力,在合適的條件下很快萌發。本研究采用倒置顯微鏡建立微分干涉差（DIC）顯微成像方法,高通量實時監測大量單個HD-1芽孢的萌發過程,并運用拉曼光譜進行對比。結果顯示,萌發過程DIC圖像亮度變化動態與芽孢吡啶二羧酸的含量變化有對應性；6 s的時間分辨率即可較好地呈現芽孢的萌發動態；以10mmol/L丙氨酸為營養萌發劑,Bt芽孢在Tris-HCl （pH 8.3）和Hepes（pH 7.4）緩沖液中的萌發動態基本相同；Bt芽孢在非營養萌發劑月桂胺中萌發極其緩慢,而在外源2,6-吡啶二羧酸鈣下萌發極其迅速。結果表明,應用DIC顯微成像技術可實現高通量實時觀測大量單個Bt芽孢萌發的動態過程,為了解Bt芽孢的萌發機制和異質性提供了極大便利。

蘇云金芽孢桿菌；微分干涉差顯微術；拉曼光譜；芽孢萌發；單細胞分析

1 引 言

芽孢是細菌的特殊休眠體,擁有獨特的成分和結構,具有極強的抗熱、抗輻射和抗化學藥物的能力[1,2]。遇到合適的條件,芽孢可以很快萌發,恢復到生長狀態。芽孢萌發并恢復新陳代謝特征是芽孢開始營養生長的關鍵一步,一旦萌發就失去了原有的抗逆能力,更容易被殺死[2,3]。

對細菌芽孢萌發機理的研究多集中于對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）[4～6]。蘇金云芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前世界上生產規模最大、應用最廣泛的生物農藥[7,8]。雖然起主要作用的是伴隨芽孢形成而產生的伴孢晶體蛋白,但Bt芽孢可以單獨或通過晶體對昆蟲起毒性作用[9],甚至有增強效應[10]。早期對Bt芽孢萌發的研究集中在Bt芽孢在昆蟲腸道內的萌發規律[11,12],并陸續在萌發條件[13]和基因調控[14,15]等領域開展研究。Bt既是廣泛應用的生物農藥,也是與炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）及蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）遺傳關系密切的物種。研究Bt芽孢萌發機制與萌發規律,可以更好地了解Bt農藥制劑施用過程Bt芽孢在田間、昆蟲腸道的存活規律,提高Bt制劑的殺蟲效果,為Bt農藥制劑生產服務,加深對細菌芽孢萌發機制的認識。

對Bt芽孢萌發的研究多應用常規的分光光度計檢測600 nm波長處的光密度變化[13],僅得到反映群體芽孢平均萌發情況的萌發率,不能了解單個芽孢的萌發信息。文獻[16]應用拉曼光譜觀測單個Bt芽孢的萌發過程,并發現其芽孢萌發存在異質性,但是其分析效率較低。文獻[17]應用微分干涉差（Differential interference contrast,DIC）顯微鏡或者相差顯微鏡成像等方法觀測枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的芽孢萌發過程,可以實時同步觀察大量芽胞的動態萌發,但尚未有應用于Bt芽孢萌發研究的報道。

本研究將DIC顯微成像方法應用于Bt芽孢,高通量監測大量單個HD-1芽孢的萌發進程,并通過拉曼光譜方法對萌發過程同步跟蹤。結果表明,單個芽孢萌發過程芽孢折光率的變化與孢內大量的2,6-吡啶二羧酸（DPA）與Ca2+的絡合物CaDPA的釋放過程相對應,通過DIC強度的變化可以監測Bt芽孢的萌發進程,而且可以了解常規方法無法觀測的芽孢皮層水解的過程。DIC顯微成像技術可以高通量實時觀測大量單個Bt芽孢萌發動態,為了解Bt芽孢的萌發機制和異質性提供了極大便利。

2 實驗方法

2.1 實驗材料

蛋白胨和酵母提取物（英國Oxiod公司）,月桂胺和DPA（美國Sigma公司）,其它試劑均為國產分析純或者生物純試劑。蘇金云芽孢桿菌（B.thuringiensis）HD-1菌株（中國普通微生物菌種保藏管理中心）。

種子培養基（LB）：蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,pH 7.4～7.6。

液體培養基（CCY）：0.5mmol/LMgCl2·6H2O,0.01mmol/LMnCl2·4H2O,0.05mmol/L FeCl3· 6H2O,0.05mmol/L ZnCl2,0.2mmol/L CaCl2·6H2O,13mmol/L KH2PO4,26mmol/L K2HPO4,谷氨酰胺20 mg,酸水解干酪素1 g,酶水解干酪素1 g,酵母提取物0.4 g,甘油0.6 g,以去離子水定容至1000 mL。在121℃高溫滅菌20min。

萌發劑：10mmol/L丙氨酸,0.8mmol/L月桂胺,45mmol/L CaDPA。

緩沖液：25mmol/L（pH 7.4）Hepes緩沖液,25mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）。

2.2 芽孢制備

菌株在LB固體培養基活化24～36 h,挑取單菌落,轉接入LB液體培養基,200 r/min過夜培養；按1％ 的比例轉入產孢培養基（CCY）,200 r/min培養48～60 h。鏡檢芽孢率達到99％后,5000 r/min離心收集、純化芽孢,無菌水洗滌10次,4℃避光保存備用。培養溫度均為30℃。

2.3 芽孢萌發

將待分析的Bt芽孢用無菌水稀釋為108個/mL,經過70℃水浴30min、0℃冰浴15min的熱激處理后,吸取2μL滴加在蓋玻片上,真空干燥,將蓋玻片固定在自制的恒溫平臺上。參考芽胞萌發的常規條件[5,13],觀察營養萌發劑和非營養萌發劑誘發的Bt芽孢萌發過程。營養萌發劑是指可以作為細胞生長的營養物質的一類萌發劑,非營養萌發劑則不能作為細胞生長的營養物質,如鹽類、表面活性劑等。（1）營養萌發 加入預熱萌發劑（含10mmol/L丙氨酸的25mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸的（Hepes）緩沖液（pH 7.4）或者Tris-HCl緩沖液（pH 8.3））,培養溫度37℃；（2）非營養萌發 待分析芽孢不經過熱激處理,順序加入45mmol/L CaDPA或者0.8mmol/L月桂胺和25mmol/L Hepes緩沖液（pH 7.4）,培養溫度分別為30℃和45℃。根據實驗需要,每1 s、6 s或12 s采集一幅DIC圖像,45mmol/LCaDPA的萌發過程觀察50min,其它實驗持續觀察2 h。

2.4 顯微拉曼光譜收集

應用單細胞激光拉曼光譜系統[18,19]聚焦在單個芽孢上采集拉曼光譜。激光強度為5 mW,從加入萌發劑開始連續采集拉曼光譜,每個光譜的積分時間為15 s,直到芽胞萌發后30～50min。

2.5 微分干涉差顯微成像測定

微分干涉差顯微術是以平面偏振光為光源,光線經過棱鏡折射后分成兩束,當光通過細胞時,光的相位發生變化,通過細胞厚而精密的部位（如核）時光速變慢,與通過鄰近薄的部位（如胞質）的光之間產生相位偏移,當兩束光線再聯合起來時產生干涉效應,顯示活細胞的細節。芽孢的核心是一個CaDPA的巨型倉庫,并且水的含量非常少,折射率高,DIC顯微鏡將其轉換成一個振幅圖像,可通過CCD將其記錄下來。在萌發過程中,芽孢內部物質（其中主要的大分子為CaDPA）大量的釋放并與周圍水分子進行置換,折射率發生變化[20]。

將DIC顯微鏡（Olympus IX81,日本Olympus公司）稍加改造,并接入高性能CCD（CoolSNAP cf2,美國Photometrics公司）,實現同步監測芽孢萌發過程的拉曼光譜和DIC圖像（圖1）。通過自編VC程序,每隔一定的時間自動采集一幅DIC圖像,圖像采集過程通過顯微鏡自帶的穩焦模塊保持圖像始終處于同一焦平面上。圖像處理：基于芽孢的相襯圖像的強度比背景高（圖2D）,用Matlab軟件編寫程序,設置強度閾值將圖像轉換成二進制的黑白圖像；以單個芽孢為中心,計算芽孢范圍內20個像素位點白色區域的平均強度,作為芽孢圖像信號積分,依時間函數繪制成芽孢萌發過程的實時DIC信號強度變化曲線（圖2）。

圖1 實驗中所用微分干涉差顯微成像系統和拉曼光譜系統示意圖Fig.1 Setup schematic of differential interference contrast（DIC）microscopy imaging system and Raman spectroscopy system used in this work.

圖2 單個芽孢與伴孢晶體蛋白的拉曼光譜（A）；DIC顯微成像技術（B）與實時拉曼光譜（C）同步分析a,b,c 3個Bt芽孢萌發的動態過程；D是圖B和圖C中a,b兩個芽孢的DIC圖像變化過程。Fig.2 Raman spectra of single spore and crystal protein from B.thuringiensis（Bt）（A）.Simultaneous monitoring of the germination of three individual Bt spores by DICmicroscopy imaging（B）and Raman spectroscopy（C）.（D）,DIC images of germination process of spore a and b showing in Fig.B and C

3 結果與分析

3.1 DIC與拉曼光譜同步監測單個芽孢萌發

芽孢萌發過程中經歷3個明顯階段：萌發遲滯期、孢內CaDPA釋放階段和肽聚糖皮層溶解階段[5]。圖2是應用DIC顯微成像和共焦顯微拉曼實時同步分析同一Bt芽孢的萌發動態過程。伴隨著芽孢的形成,生成的伴孢晶體蛋白是Bt生物農藥的關鍵成分,大小與芽孢類似,但顯示出顯著不同的拉曼光譜特征峰（圖2A）,其中1017 cm-1是芽孢CaDPA的特有峰,其峰面積可定量芽孢的CaDPA總量[16]。圖2B是芽孢萌發過程DIC圖像亮度變化動態,設定芽孢與萌發劑開始接觸的時間為0,孢內CaDPA開始快速釋放的時間為遲滯時間tlag,孢內CaDPA釋放完畢的時間為trelease,芽孢皮層完全溶解的時間為tlys,定義CaDPA釋放需要的時間為Δtrelease=trelease-tlag,皮層溶解所需時間為Δtlys=tlys-trelease。圖2D顯示對應的芽孢圖像,每個芽孢被小的暗條分成兩個亮的部分,這是由于芽孢中心相位梯度形成,DIC圖像越亮,CaDPA的含量越高。

為了確認芽孢萌發過程DIC圖像亮度與孢內CaDPA釋放的對應關系,通過顯微拉曼光譜同時記錄同一芽孢的DIC圖像和拉曼光譜,計算芽孢的CaDPA特征峰1017 cm-1的峰高,畫出其變化曲線（圖2C）。在CaDPA開始大量釋放前（tlag）,芽孢的DIC圖像亮度和1017 cm-1峰已經逐漸降低；tlag后, DIC圖像亮度和1017 cm-1峰強度都快速降低,直到孢內CaDPA完全釋放（trelease）,1017 cm-1峰完全消失；之后DIC圖像亮度隨著芽孢皮層溶解緩慢下降,并逐漸保持基本不變。因此,在Bt芽孢萌發過程中,孢內CaDPA釋放過程（即trelease時間點前）DIC圖像亮度與CaDPA的含量變化高度一致,可以通過DIC強度的變化監測Bt芽孢的萌發進程,而且可以獲知常規方法無法獲知的芽孢皮層水解的過程。

3.2 單個Bt芽孢萌發細節

對比了DIC成像在1,2,6,9和12 s等不同的時間分辨率下監測同一單個Bt芽孢的萌發動態, 圖3中是2,6和12 s的動態曲線,每個點代表一個圖像采集時間點。2,6和12 s的分辨率均可以顯示整個芽胞萌發動態,2 s的時間間隔非常短暫,記錄的點非常緊湊,有時不能很好地判斷萌發各階段的準確時間點,且記錄的數據量很大；而12 s的時間分辨率的時間間隔略大,芽孢肽聚糖皮層溶解過程的萌發細節不明顯,容易被忽略；6 s的時間分辨率可清晰地展示每個階段的萌發細節。表1統計了30個芽孢在不同時間分辨率下的萌發參數,t-測驗顯示無顯著差異。對比不同時間分辨率下的萌發曲線,結合萌發參數統計,時間分辨率6 s即可準確定位CaDPA的快速釋放過程,適合觀察芽孢萌發動態細節。

表1 Bt芽孢不同時間間隔下得到的萌發參數*Table 1 Germination parameters of B.thuringiensis spores recorded at different time intervals

3.3 高通量實時分析大量單個Bt芽孢萌發

在上述實驗基礎上,應用DIC成像實時監測了大量Bt芽孢在不同的萌發劑和萌發條件下的萌發過程。在顯微鏡同一視野下同時監測并記錄300～700個芽孢的萌發過程,監測時間為120min。每隔5～10min統計一次已經萌發的芽孢數,得到的群體曲線見圖4A。在10mmol/L營養萌發劑丙氨酸激發下,Bt芽孢在Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）和Hepes緩沖液（pH 8.3）中的群體萌發過程基本相同,加入萌發劑后,芽孢就陸續開始萌發,多數芽胞在20min內萌發,而95％以上的芽孢在60min內萌發,但仍然約有1％的孢子在120min的觀察期內未萌發；而在45mmol/L非營養萌發劑CaDPA下,芽孢萌發極快,95％以上的芽孢在10min內萌發,約有0.2％孢子在120min的觀察期內未萌發；同樣是非營養萌發劑,Bt芽孢經月桂胺誘發,在120min的觀察期內僅有約4％芽孢萌發。原因可能是兩者所誘發的芽胞萌發機制不同,外源CaDPA通過激活皮層水解酶CwlJ水解位于芽孢皮層的肽聚糖,進而引起孢內CaDPA的釋放[3],而月桂胺則可能是直接或間接打開釋放CaDPA的通道[21]。

圖3 同一Bt芽孢不同時間間隔（2 s,6 s,12 s）的萌發過程動態曲線Fig.3 Germination dynamics of single B.thuringiensis spore recorded in the time intervals of2 s,6 s and 12 s

圖4（B～D）是隨機選擇的6個單個芽孢的萌發動態,將其DIC初始強度歸一為1,萌發后DIC強度的最低值,歸一為0。由圖4可見：（1）在同樣的萌發條件下,芽孢萌發的動態過程是類似的,顯著不同的是芽孢DIC強度快速降低的開始時間（即孢內CaDPA開始快速釋放的時間,tlag）；（2）在tlag時間點前,芽孢的亮度變化很小,約下降5％ ～10％,說明在tlag前,孢內CaDPA僅有少量釋放；（3）tlag時間點后,芽孢的亮度快速下降,到trelease（CaDPA快速釋放階段結束,圖2）時,芽孢的亮度約為初始的70％～80％；（4）trelease后,芽胞圖像亮度降低約5％ ～10％,這是芽胞皮層水解的過程。

隨機選擇約 50個芽孢,統計 tlag,trelease,tlys, Δtrelease和 Δtlys等萌發參數。 由表 2可知,（1）在10mmol/L丙氨酸觸發下,Bt芽孢在Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）和Hepes緩沖液（pH 8.3））下的萌發參數基本相同；（2）與圖4B和4C顯示的萌發動態過程類似,在同樣的萌發條件下,芽孢快速釋放孢內DPA的過程基本相同,Δtrelease值為1.0～1.6min,其標準差（SD值）約為0.6min；（3）在同樣的萌發條件下,芽孢萌發的異質性表現在tlag值顯著不同,在10mmol/L丙氨酸激發下,其SD值約為10min；相應地,受tlag值的異質性影響,芽胞萌發的trelease,tlys值也差異顯著；（4）在外源CaDPA的觸發下,芽孢皮層溶解的過程（即Δtlys）比丙氨酸觸發快。

上述結果表明,采用單個視野的DIC成像方法可以同時觀察300～700個芽胞的萌發過程。如果采用自動轉換平臺,每6 s采集一幀圖像,考慮視野轉換和曝光所需的時間,在6 s時間內可以循環采集4個視野的圖像,則在同一次實驗中可以觀察多達2800個以上的芽胞萌發過程。

表2 Bt HD-1芽孢在不同的萌發劑、不同緩沖液下的萌發參數*Table 2 Germination parameters of B.thuringiensis HD-1 spores（n=50）

4 結論

通過改造微分干涉差（DIC）顯微鏡,接入高性能CCD,用顯微鏡自帶的穩焦模塊保持圖像始終處于同一焦平面上,通過自編程序,每隔一定的時間自動采集一幅DIC圖像,觀察了Bt芽孢的動態萌發過程。經與拉曼光譜同步監測,孢子釋放CaDPA的過程與DIC圖像強度變化一致；應用上述實驗系統同步觀察了大量Bt芽孢在營養萌發劑和非營養萌發劑下的萌發動態發現,Bt芽孢在Tris-HCl（pH 8.3）緩沖液和Hepes（pH 7.4）緩沖液中的萌發情況基本相同,而在非營養萌發劑月桂胺中萌發非常緩慢,在外源CaDPA下卻很迅速。在相同的萌發條件下,同一群體內Bt芽孢間的萌發異質性主要體現在參數tlag上。研究結果表明,通過DIC顯微鏡可以高通量分析單個Bt芽孢萌發的動態過程,闡明其萌發特征,為了解Bt芽孢的萌發機制和異質性提供了極大便利。

圖4 A,Bt HD-1芽孢在不同萌發條件下的萌發曲線；B～D,不同萌發劑條件下6個芽胞各自萌發的動態過程：B,10mmol/L丙氨酸,25mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）；C,10mmol/L丙氨酸,25mmol/L Hepes （pH 7.4）；D,45mmol/L CaDPA。Fig.4 （A）Germination of B.thuringiensis HD-1 spores and（B-D）kinetics of germination of 6 individual spores.Spores were germinated in 25mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）（B）or in 25mmol/L Hepes buffer （pH 7.4）（C）with 10mmol/L alanine,or with 45mmol/L calcinm dicarboxylic acid（CaDPA）（D）

1 Paredes-Sabja D,Sarker M R.Future Microbiol.,2009,4（5）：519-525

《國網通用設計》因篇幅受限，裝配式建筑墻體只推薦了形式，沒有詳圖設計。陜西西安某110 kV變電站，采用《國網通用設計》中全戶內變電站110-A2-3方案[3](應用本文時應以《國網通用設計》中該方案的適用條件為準)。該變電站為城市型全戶內變電站，《國網通用設計》統一了配電裝置樓的墻體材料：外墻采用壓型鋼板復合板，內墻采用輕鋼龍骨石膏板隔墻。在該工程設計時，根據規程規范的防火、節能、降噪等要求，分別對變電站的內隔墻、外墻，進行墻體參數細化設計研究，內墻主要根據墻體材料耐火極限進行設計，外墻根據防火、節能、降噪等要求進行設計計算。

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20 Zhang P,Kong L,Wang G,Setlow P,Li Y Q.Appl.Environ.Microbiol.,2011,77（14）：4754-4769

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（Received 27 April 2015；accepted 10 August2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.11264004,31460035）

High-throughput Investigation of Germ ination of Individual Bacillus Thuringiensis HD-1 Spores by Differential Interference Contrast M icroscopy Imaging

CHEN Yue1,2,PENG Li-Xin2,WANG Xiao-Chun2,LIYong-Qing3,LIU Jun-Xian*1,WANG Gui-Wen*21（College of Physics Sciences＆Technology,Guangxi Normal University,Guilin 541004,China）
2（Laboratory of Biophysics,Guangxi Academy ofSciences,Nanning 530007,China）
3（Department of Physics,East Carolina University,Greenville,NC 27858,USA）

Bacillus thuringiensis（Bt）,a unique bacterium which forms parasporal crystal protein and spore in parallel,is themostwidely used environmentally in compatible biopesticide worldwide.Bt spore has a strong resistance to stress and adversity,and germinates rapidly once conditions are favorable for growth.In this work,differential interference contrast（DIC）microscopy was used tomonitor the germination of individual Bt HD-1 spores,and the germination process was also investigated with Raman spectroscopy simultaneously.Experiment results showed that the decrease in normalized DIC intensity of Bt spore was consistent with the release of pyridine-2,6-pyridine dicarboxylic acid（dipicolinic acid[DPA]） determined by Raman spectroscopy.Temporal resolution of 6 seconds could well describe the dynamic process of spore germination.Bt spore showed similar germination kinetics triggered either by 10mmol/L alanine at 37℃ in 25mmol/L Tris-HCl buffer（pH 8.3）or in 25mmol/L Hepes buffer（pH 7.4）.Most spores did not germinate triggered by dodecylamine but germinated rapidly triggered by exogenous Ca-DPA.These results indicated that DIC microscopy imaging could be used to observe germination of individual Bt spores in real-time quantitatively, and help to the understanding ofmechanisms of Bt spore germination and its heterogeneity.

Bacillus thuringiensis；Differential interference contrastmicroscopy；Raman spectroscopy；Spore germination；Single-cell analysis

10.11895/j.issn.0253-3820.100345

2015-04-27收稿；2015-08-10接受

本文系國家自然科學基金項目（Nos.11264004,31460035）資助

E-mail：jxliu@mailbox.gxnu.edu.cn；wguiwen@gxas.cn