高濃度抗壞血酸存在下氮摻雜石墨烯/殼聚糖修飾電極對尿酸的選擇性測定

李寧波 何鳳云李麗 胡耀娟 白程超 段雨晴（南京曉莊學院,環境科學學院,南京211171）

高濃度抗壞血酸存在下氮摻雜石墨烯/殼聚糖修飾電極對尿酸的選擇性測定

李寧波 何鳳云*李麗 胡耀娟 白程超 段雨晴
（南京曉莊學院,環境科學學院,南京211171）

采用一步水熱合成法制備了氮摻雜石墨烯,采用滴涂法制備了氮摻雜石墨烯/殼聚糖修飾電極（N-GN-CS/GCE）,研究了在大量抗壞血酸存在下尿酸在此修飾電極上的伏安行為。結果表明,尿酸在此修飾電極上有一個明顯的氧化峰,其峰電流約為裸電極的7倍；同時,氮摻雜石墨烯/殼聚糖復合修飾材料顯著提高了尿酸對抗壞血酸的選擇性,尿酸和抗壞血酸的峰電位差可達362 mV,可實現高濃度抗壞血酸存在下尿酸的選擇性測定。優化了修飾材料的滴涂量、溶液pH值、掃描速度等實驗參數,利用差分脈沖伏安法對尿酸進行測定,尿酸的脈沖峰電流與尿酸濃度分別在0.1～20μmol/L和20～400μmol/L濃度范圍呈良好的線性關系,檢出限為0.01μmol/L,相對標準偏差為3.3％（n=8）。將本方法用于實際尿樣的測定,回收率為99.7％～103.4％。

氮摻雜石墨烯；抗壞血酸；尿酸

1 引 言

尿酸（UA）是嘌呤的主要代謝產物,在人體體液中的含量變化可反映出人體內新陳代謝和免疫等機能的狀況[1]。UA含量異常是痛風、腎功能衰竭和高尿酸血癥萊-尼綜合征的征兆[2]。因此,尿酸的檢測和分析對臨床診斷、了解病情進展具有重要意義。目前,尿酸的檢測方法有熒光法[3]、高效液相色譜法[4]、酶方法[5]和電化學方法[2,6～10]等。與其它方法相比,電化學具有操作簡便,成本低廉,靈敏度高,檢出限低等優點。但是利用電化學方法測定UA的一個主要問題是體液中共存的抗壞血酸（AA）的干擾。因此,建立在大量抗壞血酸（AA）存在下準確測定UA的方法,更具有實際意義。

石墨烯是一種由單層碳原子緊密堆積成二維蜂窩狀晶體結構的新型炭質材料,具有比表面積高、導電性能好、機械強度高、易于修飾/功能化及可大規模生產等優點,已成為當前的研究熱點之一[11,12]。研究者發現純石墨烯的活性位點不夠,不具有選擇性,在實際應用中不具備很好的匹配度等問題。對石墨烯進行摻雜是一種彌補石墨烯的缺陷有效的方法,其中氮摻雜的研究最多[13],氮原子能誘導更多的正電荷到相鄰的碳原子上,有效提高陰離子交換性能和電催化活性,并且具有更優異的穩定性。

本研究以尿素作為氮源和還原劑[14,15],采用一步水熱法合成氮摻雜石墨烯,合成的氮摻雜石墨烯能均勻分散在殼聚糖溶液中,且性能穩定。用氮摻雜石墨烯/殼聚糖復合材料制備修飾電極,研究了尿酸在此電極上的電化學行為,優化了測定條件,探討了尿酸在此電極上的氧化機理,采用電化學方法測定尿酸,并實現了大量抗壞血酸存在下尿酸的選擇性檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660C電化學工作站（上海辰華儀器公司）；S-4800場發射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；KQ2200型超聲波清洗器（功率100W,昆山市超聲儀器公司）；pH-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）。2400Ⅱseries CHN元素分析儀（美國PE公司）。ZD-F12型冷凍干燥箱（南京載智自動化設備公司）。

尿素（分析純,上海久億化學試劑有限公司）；石墨粉（光譜純）、抗壞血酸（分析純,國藥集團化學試劑有限公司）,其它試劑均為分析純。實驗用水均為二次去離子水。

2.2 氮摻雜石墨烯（N-GN）的制備

以石墨粉為原料,通過改進的文獻[16]的方法制備氧化石墨烯（GO）。采用一步水熱合成法[14,15], 取15 mg GO溶于30 mL水中,超聲10 min,使GO均勻分散。依次加入3 mL 0.1 mol/L NaOH溶液, 0.45 g尿素,混合后超聲數分鐘。放入反應釜中,在160℃下反應12 h。用水洗滌至中性,離心3次,去除溶液,得到黑色沉淀,在-10℃冷凍干燥20 h,即得氮摻雜石墨烯（N-GN）。

2.3 修飾電極的制備

玻碳電極分別用0.3和0.05μm Al2O3粉末在麂皮上打磨成鏡面,用二次去離子水小心洗滌后,再依次放入HNO3（1∶1,V/V）、乙醇、去離子水中各超聲3 min,自然干燥備用。

取1 mg N-GN溶于1 mL 0.5％HAc殼聚糖溶液（CS）,超聲至均勻分散,形成1mg/mL N-GN復合物分散液。取8μL分散液,滴涂在玻碳電極表面,緩慢滴加使其均勻分散,在室溫下自然晾干,制得氮摻雜石墨烯/殼聚糖修飾玻碳電極（N-GN-CS/GCE）。

2.4 實驗方法

取適量尿酸（UA）標準溶液或樣品待測液于電解池中,采用三電極體系,以GCE或修飾電極為工作電極,鉑片電極為輔助電極,飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。采用CV或DPV進行掃描,記錄-0.2～0.8 V的峰電流和峰電位,每次掃描結束后,用二次水沖洗電極,并用吸水紙吸干后,即可進行下一次測定。

3 結果與討論

3.1 氮摻雜石墨烯的表征

圖1為氮摻雜石墨烯（a）及氮摻雜石墨烯/殼聚糖（b）復合物的掃描電鏡圖。從圖1可見,氮摻雜石墨烯提供了大的比表面積,而殼聚糖的加入,可以使氮摻雜石墨烯在電極上更好地成膜,提高修飾電極的穩定性。

利用元素分析儀（CHN）對氧化石墨烯和冷凍干燥后的氮摻雜石墨烯進行碳氮含量測定,結果表明,氧化石墨烯中的碳含量為42.40％,氮含量為0；氮摻雜石墨烯中碳含量為68.88％,氮含量為5.61％,與蘇鵬等[14]報道的以尿素為氮源（GO與尿素比例為1∶30）得到的氮摻雜石墨烯中氮的含量相當,說明通過水熱法可以制備氮摻雜石墨烯。

圖1 氮摻雜石墨烯（a）和氮摻雜石墨烯/殼聚糖（b）復合物的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrographs of nitrogen-doped graphene（N-GN）（a）and nitrogen-doped graphene/chitosan（N-GN-CS）composite（b）

3.2 UA與AA在不同電極上的電化學響應

將不同電極放入僅含有0.2mmol/L UA和10mmol/L AA-0.2mmol/L UA的PBS緩沖溶液（pH 5.5）中,以0.1 V/s循環伏安掃描,得到的循環伏安圖。從圖2A可見,UA在4種電極上均只出現氧化峰,說明 UA在電極上為完全不可逆氧化過程。UA在 GCE（曲線 a）上有一個小氧化峰（Epa=0.376 V,Ipa=3.142μA）；GO/GCE（曲線 b）的氧化峰電流略有增加（Epa=0.404 V, Ipa=4.361μA）；在GN/CS/GCE（曲線 c）的氧化峰電流增大,約為裸電極的3倍（Epa=0.402 V, Ipa=9.4μA）,電位較裸電極正移26 mV,峰形有所改善；UA在N-GN-CS/GCE（曲線d）的氧化峰電流增大,約為裸電極上的7倍（Epa=0.380 V,Ipa=21.97μA）,峰電流明顯增大。這是由于氮摻雜石墨烯大的比表面積和較多的反應活性點,使其對UA具有良好的電催化作用,同時良好的導電能力加快了電子傳遞速度,也提高檢測的靈敏度；此外,該復合膜具有高的選擇性和強的抗干擾能力,使其在大量抗壞血酸存在下,能與UA很好地分離,實現UA的準確測定。圖2B顯示了在10mmol/L AA存在下,0.2mmol/L UA在不同電極上的電化學行為。從圖2B可見,UA和AA在GCE（曲線a）和GO/GCE（曲線b）上無法實現分離,僅出現一個寬峰；在GN-CS/GCE（曲線c）出現了兩個峰,但峰型差,電流信號弱；在N-GN-CS/GCE上,UA和AA可以實現良好分離,兩者峰電位差可達362 mV,說明氮摻雜石墨烯在尿酸的電化學檢測中比石墨烯更具有優勢,將此修飾電極用于尿液中尿酸的測定,可不受尿液中大量AA的干擾。

3.3 pH值對UA電化學響應的影響

圖2 （A）尿酸（0.2mmol/L）在GCE（a）,GO/GCE（b）,GN-CS/GCE（c）和N-GN-CS/GCE（d）上的循環伏安圖（A）；（B）大量抗壞血酸（10mmol/L）存在下尿酸（0.2mmol/L）在GCE（a）,GO/GCE（b）,GN-CS/GCE（c）和N-GN-CS/GCE（d）上的循環伏安圖（B）Fig.2 Cyclic voltammograms of uric acid（0.2mmol/L）at bare GCE（a）,GO/GCE（b）,GN-CS/GCE（c）and N-GN-CS/GCE（d）in the absence（A）and presence（B）of ascorbic acid（10mmol/L）緩沖溶液（Buffer）：0.1 mol/L PBS（pH 5.5）；掃速（scan rate）：0.1 V/s。

圖3給出了不同pH條件下UA在N-GN-CS/GCE上的循環伏安圖。隨著pH值增大,UA的氧化峰電位逐漸負移,說明電極反應過程有質子參與。經過擬合,UA氧化峰電位與pH值呈良好的線性關系,線性方程為 Epa（V）=-0.0522pH+ 0.6692（R2=0.9913）,方程斜率為-52.2 mV/pH,接近理論斜率-59 mV/pH,說明UA在N-GN/GCE上反應過程中轉移的質子與電子數比為1。pH值對氧化峰電流也有影響；pH=5.5時,氧化峰電流達到最大值。因此,選擇pH=5.5的PBS緩沖溶液作為支持電解質。

圖3 0.2mmol/L尿酸在不同pH的磷酸鹽緩沖溶液中在N-GN-CS/GCE上的循環伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of 0.2mmol/L uric acid at N-GN-CS/GCE in PBS solution with different pH valuesa-g：pH 5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0,9.0；scan rate：0.1 V/s.

3.4 掃描速度的影響

考察了掃速對UA伏安行為的影響,結果表明,在0.01～0.2 V/s范圍內,隨著掃速增大,UA的氧化峰電流不斷增大,且氧化峰電流（Ipa）與掃描速度（v）呈良好的線性關系,線性方程為：Ipa（μA）= 55.464v+2.974（R2=0.9910）,這說明UA在N-GN-CS/GCE電極上的氧化為吸附控制。且隨著掃描速度的增大,電位逐漸正移,是不可逆反應。

3.5 UA在N-GN-CS/GCE上的氧化過程

對于吸附控制的不可逆的電極反應過程,根據Laviron公式[17]公式：

式中,α表示電子轉移系數,kθ為標準速率常數,n為電子轉移數,v為掃描速度,Eθ為標準電位。通常對于不可逆電極過程α=0.5,經過計算（Ep=0.056log v+0.4555,R2=0.9862）,n=1.9,所以該反應是一個2電子2質子的電化學過程。

3.6 線性范圍和檢出限

在pH=5.5的PBS緩沖溶液中,不同濃度的UA差分脈沖伏安（DPV）圖如圖4所示。在0.1～20μmol/L和20～400μmol/L范圍內,UA的氧化峰電流與濃度呈良好的線性關系,線性方程分別為：Ip（μA）=0.347C（μmol/L）+0.3573（R2=0.9957）和Ip（μA）=0.09721C（μmol/L） +6.0760 （R2= 0.9942）,檢出限（S/N=3）為0.01μmol/L。與已報道的對UA的電化學方法[2,6～10,19～23]相比,本方法線性范圍寬,檢出限較低,能滿足對實際樣品的測定。

3.7 重現性、穩定性和干擾實驗

圖4 不同濃度的UA在N-GN-CS/GCE上的差分脈沖伏安圖Fig.4 Differential pulse voltammograms of different concentrations of uric acid at N-GN-CS/GCE曲線 a～k：0.1,0.2,0.4,2,4,8,20,40,80,200和400μmol/L。緩沖溶液：0.1 mol/L PBS（pH=5.5）；掃速：0.1 V/s；電位增量0.004 V,振幅0.05 V,脈沖寬度0.05 s,脈沖周期0.2 s,沉積電位為-0.4 V,沉積時間是40 s。Buffer：0.1 mol/LPBS（pH=5.5）；Scan rate：0.1 V/s；Potential increase：0.004 V；Amplitude：0.05 V；Pulse width：0.05 s；Pulse period：0.2 s；Deposition potential：-0.4 V；Deposition time：40 s.

采用差分脈沖法連續測定0.1mmol/L UA標準溶液8次,峰電流的相對標準偏差（RSD）為3.3％。在相同的實驗條件下制備5支修飾電極,平行測定0.1mmol/L UA標準溶液,RSD為4.5％。將修飾電極避光浸入空白底液,4℃保存5 d后再次進行測定,峰電流下降為原來的96.7％。

在含0.1mmol/L UA的PBS溶液（pH 5.5）中測定了一些可能共存的無機離子和有機物對UA的干擾。結果表明,在允許測量誤差不超過5％的情況下,100倍的Ca2+、Cl-、Na+、K+、Ba2+和,50倍的尿素、酪氨酸、L-賴氨酸,10倍的葡萄糖、腎上腺素、多巴胺、蔗糖和檸檬酸鹽均不干擾測定。本方法對UA的測定具有良好的選擇性,可用于尿樣中UA含量的測定。

3.8 尿樣測定及回收率實驗

將制備的傳感器用于尿樣中UA的測定,每次取2.50 mL尿樣于含有1mmol/L AA的0.10 mol/L PBS溶液中,定容至50 mL。用DPV進行測定。加入已知樣的標準品進行回收率測定,測定結果見表1。

表1 尿樣中尿酸的測定（n=3）Table 1 Determination of uric acid in urine samples（n=3）

4 結論

制備的氮摻雜石墨烯/殼聚糖修飾電極（N-GN-CS/GCE）能夠促進UA在此電極上的電子轉移,并能有效消除尿液中共存的AA的干擾。據此建立的測定UA的電化學方法具有線性范圍寬、檢出限低等優點,為實際尿液中UA的準確、靈敏監測提供了新方法。

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（Received 27 April 2015；accepted 10 August2015）

Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.11254004,31460035）

Selective Determ ination of Uric Acid at Nitrogen-doped Graphene/Chitosan Com posite M odified Electrode in the Presence of a Large Amount of Ascorbic Acid

LINing-Bo,HE Feng-Yun*,LILi,HU Yao-Juan,BAICheng-Chao,DUAN Yu-Qing
（School of Environmental Science,Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing 211171,China）

Nitrogen-doped graphene was synthesized by one-step hydrothermal method.A nitrogen-doped graphene-chitosan modified electrode（N-GN-CS/GCE）was prepared and the electrochemical behavior of uric acid in the presence of a large amount of ascorbic acid was investigated at themodified electrode.The peak current of uric acid at themodified electrode was7 times as that at unmodified electrode.The peak separation of uric acid and ascorbic acid was 362 mV and uric acid could be accurately determined in the presence of a large amount of ascorbic acid.Some experimental parameters such as dopping volume,pH and scan rate were optimized and a standard curve was also established using differential pulse voltammetry.The linear range between the peak current and the concentration of uric acid was 0.1～20μmol/L and 20-400μmol/L,and the detection limitwas estimated to be 0.01μmol/L.The proposedmethod was applied to the analysis of uric acid in human urine sample with recoveries between 99.7％and 103.4％.

Nitrogen dopped graphene；Ascorbic acid；Uric acid

10.11895/j.issn.0253-3820.150340

2015-04-27收稿；2015-08-10接受

本文系南京大學生命分析國家重點實驗室開放研究基金（No.SKLACLS1308）、江蘇省大學生創新訓練項目（No.201411460025Y）、南京曉莊學院化學一級重點學科項目資助

E-mail：hefengyun1976@163.com