熒光分析活性氧在血管緊張素Ⅱ誘導心肌成纖維細胞增殖中的作用

王立英蘇海燕王璇周艷楊世杰（北華大學基礎醫學院生理教研室,吉林0）（吉林省腫瘤醫院預防保健科,長春00）（吉林大學基礎醫學院藥理教研室,長春00）

熒光分析活性氧在血管緊張素Ⅱ誘導心肌成纖維細胞增殖中的作用

王立英1蘇海燕2王璇1周艷*1楊世杰31（北華大學基礎醫學院生理教研室,吉林132013）2（吉林省腫瘤醫院預防保健科,長春130021）
3（吉林大學基礎醫學院藥理教研室,長春130021）

應用熒光分析方法探討活性氧（Reactive oxygen species,ROS）在血管緊張素Ⅱ （AngiotensinⅡ,Ang Ⅱ）誘導心肌成纖維細胞（Myofibroblasts,myoFbs）增殖中的作用。實驗中采用胰酶消化法分離、培養原代新生大乳鼠myoFbs,10％胎牛血清培養,采用2～3代myoFbs,并隨機分為正常對照組、AngⅡ處理組、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）干預組,培養12、24和36 h后,分別采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5）-Dimethylthiahiazo（-z-yl）-3,5-diphenyt-etrazoliumromide,MTT）法測定myoFbs的增殖率；硝酸酶還原法檢測myoFbs產生羥自由基（·OH）的量；利用熒光探針DCFH-DA分析檢測myoFbs中ROS的水平；免疫細胞化學染色法及熒光共聚焦測定p-PKCα的表達及膜轉位。結果顯示一定濃度的AngⅡ作用myoFbs 24 h時myoFbs增殖率明顯增加（η值（％）為117.05）；并誘導myoFbs產生大量ROS,其中myoFbs增殖率越高,·OH的含量（94.53±1.68）越高；免疫細胞化學染色及熒光共聚焦可見,AngⅡ能明顯促進p-PKCα的表達及膜轉位（與對照組比較p＜0.01或p＜0.001）；NAC（10-4mol/L）可抑制AngⅡ引起myoFbs的增殖（OD值為0.357±0.13）,減少myoFbs內ROS及·OH的量（75.57±1.48）,抑制p-PKCα的表達及膜轉位。

N-乙酰半胱氨酸；血管緊張素Ⅱ；氧自由基；心肌成纖維細胞；蛋白激酶Cα；活性氧

1 引 言

在我國,心血管疾病已經成為僅次于癌癥的第二號殺手,防止心血管疾病發生發展并降低其致死致殘率已成為我國21世紀提高人民健康水平的重中之重[1]。引起心臟病患者心肌組織變化主要是纖維細胞（Myofibroblasts,myoFbs）數量增多引起纖維化（Myofibrosis,MF）,主要是myoFbs的增殖及間質的纖維化,并引起心臟收縮功能障礙、心律失常及室顫,最終引起難治性心力衰竭,這是多種心臟疾病發展的共同結局。臨床上抗MF和逆轉心肌重塑治療過程中,先治療心臟的原發病,同時加強抗MF的治療,因此,明確MF發生的機制,尋找有效抑制MF甚至逆轉MF的藥物,減少猝死的發生機率,具有重要的現實意義,并已成為醫學研究的重點[2,3]。

目前,MF發生機制的研究多側重于在體條件下各項指標的檢測,細胞內的信號分子研究較少,且均采用傳統的免疫生化指標的檢測。為明確MF發生時的細胞內信號轉導機制,著手于體外培養myoFbs,采用熒光分析方法探討MF時細胞內各種信號分子的變化,為MF的治療提供可靠依據。

大量研究表明,氧化應激產生的各種氧自由基（Oxygen free radicals）對心血管具有細胞毒性作用,是許多心血管疾病發生的重要機理[4]。文獻[5]報道氧化應激產生的適量氧自由基可作為細胞內信號轉導分子,參與調節細胞功能。本研究以AngⅡ為myoFbs氧化應激的誘導劑,通過熒光探針DCFHDA,熒光共聚焦分析及NAC干擾,探討myoFbs增殖過程中ROS量的變化及在其中的作用,明確心肌重塑細胞內信號轉導機制及治療靶點,為心血管疾病的防治提供參考。

本實驗的前期工作中發現蛋白激酶C（Protein kinase C）參與到了MF過程中,在心肌PKC亞型中, PKCα在心肌的表達量最高,磷酸化后可由胞漿轉移至胞膜,引起系列細胞內信號傳導,從而引起細胞生物學效應改變。以往的研究多通過Westen blot等方法來探討PKCα在myoFbs增殖中的作用。本實驗通過熒光分析PKCα在myoFbs增殖及MF過程中的作用,為抗MF和逆轉心肌重塑提供了新的治療靶點。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑及動物

熒光共聚焦顯微鏡和CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；UV-5300紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；9602A酶標儀（北京艾普生物設備有限公司）；HERAEUSCO2培養箱（中國蘇凈集團安泰公司）?；钚匝鯔z測試劑盒（Reactive oxygen species assay kit,ROS碧云天生物技術研究所）；OH測定試劑盒（南京建成生物工程公司）。

Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）培養基（Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶（Dfico公司）；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、NAC、血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）均購于Sigma公司；PKCα一抗（羊抗大鼠p-PKCα抗體,Santa Cruz公司）。Wistar乳鼠（清潔級,由吉林大學動物部提供）。

2.2 實驗分組和給藥

MyoFbs隨機分為對照組、AngⅡ處理組及NAC干預組。各組細胞無血清培育12 h后,均給予1％血清的IMDM培養基,除對照組外,均給予終濃度為10-7mol/L AngⅡ,NAC干預組同時給予NAC,終濃度為1×10-4mol/L。

2.3 MyoFbs的分離與培養

取Wistar大鼠,1～3日齡,無菌開胸取心臟,預冷D-Hank′s液清洗兩次,剪成1 mm3碎片,0.125％胰蛋白酶反復消化（37℃水浴,5min/次）,收集各次消化上清液,離心（1200 r/min,10min）,棄上清液,用含10％胎牛血清的IMDM培養基重懸沉淀,制成細胞懸液,接種于培養瓶中,置37℃、5％CO2培養箱內培養。實驗采用第2～3代細胞。

2.4 細胞增殖（M TT法）

將處于對數生長期的myoFbs制成細胞懸液,以1×105個/mL濃度接種于96孔板,每孔200μL。分別給予不同的處理因素作用48 h。每孔加入5 mg/LMTT溶液20μL,37℃繼續培養4 h,終止培養,每孔加入150μL DMSO,振蕩10min后,酶標儀上于490 nm波長測吸光度（A）。

2.5 MyoFbs內·OH含量和ROS的測定

將處于對數生長期的myoFbs制成細胞懸液,以1×105個/mL濃度接種于96孔板,每孔200μL。分別給予不同的處理因素作用24 h,按試劑盒說明書進行檢測。24孔板培養的myoFbs培養48 h后,各組無血清培育12 h,各種處理因素作用24 h后,以PBS溶液沖洗3次,去除細胞培養液；加入終濃度為10mmol/L DCFH-DA,在37℃細胞培養箱內孵育20min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。用熒光共聚焦顯微鏡觀察myoFbs內的ROS,顏色越深,表明ROS生成量越多。

2.6 免疫細胞化學染色檢測p-PKCα膜轉位和表達

將第3代myoFbs放入預先放置了10 mm×10 mm蓋玻片的24孔板,置于37℃、5％CO2培養箱內培養48 h,各組無血清培育12 h,各種處理因素作用24 h后,將生長有myoFbs的蓋玻片取出,用預熱的PBS洗滌3次,每次5min,4％多聚甲醛固定30min,晾干后用SP法進行免疫細胞化學染色,陽性反應呈棕黃色細密顆粒。應用MediaCybernetics公司的Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件分析各組p-PKCα 在myoFbs中表達的平均光密度值,每個視野取5個myoFbs。

2.7 熒光共聚焦檢測p-PKCα膜轉位和表達

MyoFbs的培養及處理的前期步驟同2.6節,4％多聚甲醛固定30min,PBS洗滌3次,0.3％Triton X+100破膜15min,PBS或蒸餾水洗滌3次,1％胎牛血清封閉30min,蒸餾水沖洗3次后,加入1∶100稀釋的p-PKCα一抗（每孔300μL）,4℃過夜,次日PBS洗滌3次,加入1∶100稀釋的熒光標記的兔抗山羊二抗（每孔200μL）,避光37℃孵育30min,每孔加入300μL PI繼續孵育15min,PBS洗滌3次后,每孔加500μL PBS,檢測,陽性反應呈綠色細密顆粒。應用Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件分析各組p-PKCα在myoFbs中表達的平均綠色光密度值,每個視野取5個myoFbs。此方法便于直接觀察p-PKCα的膜轉位及表達量的變化。紅色代表myoFbs的胞核。

3 結果與討論

3.1 AngⅡ對體外培養的myoFbs增殖作用的影響

細胞增殖率按給藥與對照組吸光度（A490）的百分比計算得出。從表1數據可知,不同濃度的AngⅡ作用myoFbs12 h時,與對照組相比,與對照組相比細胞增殖不明顯；作用24 h時,與對照組相比,不同濃度AngⅡ（10-8～10-6moL/L）均可促進myoFbs增殖。濃度為10-7moL/L的AngⅡ作用時間為24 h,在三組中細胞增殖率達到最大（η,％為170.15）,隨著AngⅡ濃度的升高,作用時間的延長,細胞增殖率反而逐漸降低。目前認為,腎素-血管緊張素-醛固酮系統的激活是誘發及引起MF的主要發病機制, AngⅡ是最為常見的胞外刺激信號,也是重要的致炎致纖維化的因子,是引起MF致心肌重塑的關鍵物質。AngⅡ可與血管緊張素受體1（AT1）結合激活蛋白激酶C-絲裂素活化蛋白激酶系統[6]一系列細胞信號途徑促進myoFbs增殖。MyoFbs增殖需要適宜的AngⅡ濃度及作用時間。若濃度過低、時間過短, myoFbs增殖不明顯；而濃度過高、時間過長、由于滲透壓及營養物質消耗殆盡等,myoFbs增殖反而降低。由表1可知,AngⅡ作用細胞24h,濃度為10-7moL/L時,與各對照組相比,細胞增殖率明顯升高（p＜0.001）。

3.2 NAC對AngⅡ誘導myoFbs增殖的抑制作用

AngⅡ作用myoFbs 24 h后與對照組相比,細胞增殖率明顯升高（p＜0.01）；與AngⅡ組相比,NAC組細胞增殖率明顯降低（p＜0.01）。NAC可抑制AngⅡ誘導myoFbs增殖的作用。NAC分子中的活性巰基（-SH）,可對抗不同原因所致的組織氧化損傷。對體內氧自由基（超氧陰離子·、H2O2、羥自由基·OH等）具有明顯的拮抗作用；由于NAC易進入細胞內,對能透過細胞膜與多種細胞成分反應、導致心肌細胞損傷壞死并發生纖維化的H2O2、·OH具有抑制、清除作用[7],而抑制 myoFbs增殖,減輕MF,見表2。

表1 不同濃度的AngⅡ在不同時間對myoFbs增殖的影響Table 1 Effect of angiotensinⅡ（AngⅡ）on the proliferation ofmyofibroblasts（myoFbs）in different concentrations and time

表2 NAC對AngⅡ誘導myoFbs增殖的抑制作用（±s）Table 2 Inhibition of N-actyl-L-cysteine（NAC）on the proliferation of myoFbs induced by AngⅡ（mean±SD）group.

表2 NAC對AngⅡ誘導myoFbs增殖的抑制作用（±s）Table 2 Inhibition of N-actyl-L-cysteine（NAC）on the proliferation of myoFbs induced by AngⅡ（mean±SD）group.

ap＜0.001與對照組比較；bp＜0.05 vs.AngⅡgroup。ap＜0.001 vs.control group；bp＜0.05 vs.AngⅡ

分組Group細胞增殖率Proliferation rate ofmyoFbs（η,％）12 h 24 h 36 h對照組Control group 100 100 100 AngⅡ（10-7moL/L） 0.389±0.17 0.483±0.12a 0.412±0.14 NAC（10-4moL/L） 0.341±0.14 0.357±0.13b 0.339±0.11

表3 NAC對AngⅡ誘導myoFbs內·OH含量的抑制作用（±s）Table 3 Inhibition of NAC on the content of OH· in myoFbs induced by AngⅡ（mean±SD）

表3 NAC對AngⅡ誘導myoFbs內·OH含量的抑制作用（±s）Table 3 Inhibition of NAC on the content of OH· in myoFbs induced by AngⅡ（mean±SD）

ap＜0.05與對照組比較；bp＜0.01與AngⅡ組比較。ap＜0.05 vs.control group；bp＜0.01 vs.AngⅡgroup.

分組Group心肌成纖維細胞中·OH的含量The content of·OH in myoFbs（U/mL）12 h 24 h 36 h對照組Control group 79.45±1.43 81.25±1.25 78.90±1.73 AngⅡ（10-7moL/L） 89.50±1.38a 94.53±1.68a 91.07±1.06 NAC（10-4moL/L） 79.41±2.51b 75.57±1.48b 74.92±1.18

3.3 NAC對AngⅡ誘導myoFbs內·OH含量的影響

由表 3可見,AngⅡ作用于myoFbs不同時間,引起myoFbs產生·OH的量呈時間依賴性,隨著時間延長,myoFbs內·OH的量逐漸增加,與對照組相比差異顯著（p＜0.01）。NAC干預組與AngⅡ處理組相比,·OH的產生量明顯降低（p＜0.05）,而與對照組相比差異不顯著（p＞0.05）?？梢奛AC對myoFbs內·OH的產生具有抑制作用。NAC能夠通過減少·OH的生成而抑制myoFbs的增殖。

3.4 NAC對AngⅡ誘導myoFbs內ROS含量的影響

采用熒光共聚焦顯微鏡直接觀察myoFbs內ROS量的變化,在myoFbs胞漿中可見到綠色的熒光顆粒,便是ROS的表達,綠色越深,表明ROS量越高。與對照組相比,AngⅡ組ROS量最多（p＜0.01）；與AngⅡ組相比,NAC組ROS含量較少（p＜0.05）,見圖1A。圖1B是應用Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件分析圖1A各組ROS的量繪制而成。

圖1 熒光共聚焦（A）和定量分析（B）N-乙酰半胱氨酸對血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞內活性氧含量的影響（400×）Fig.1 NAC effects on content of reactive oxygen species（ROS）by AngⅡ in membrane ofmyoFbs with a laser confocal scanningmicroscope（A）and quantitative analysis（B）（400×）a：p＜0.01 vs control group；b：p＜0.05 vs AngⅡgroup.

利用活性氧檢測試劑盒測定ROS,活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DCFH-DA進行ROS檢測的試劑盒。DCFH-DA本身無熒光,可以自由穿過細胞膜,進入細胞內,可被細胞內的酯酶水解,生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜,使探針很容易地被裝載到細胞內。細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH,生成DCF。檢測DCF的熒光即可知細胞內ROS的水平[8,9]。由于myoFbs是貼壁培養細胞,因而采用原位裝載探針方法,即按照1∶1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μmol/L,去除細胞培養液,于24孔板的一個孔加入至少300μL已稀釋的DCFH-DA。在37℃細胞培養箱內孵育20min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次,充分去除未進入細胞內的DCFH-DA[1]。AngⅡ能提高NADH/NADPH氧化酶的生物學活性及促進ROS的產生,而引起心肌肥厚[10]。少量ROS可調節心肌細胞的正常生理功能,而不損傷心肌細胞的作用。但在過量AngⅡ刺激因子的影響下,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶被異常激活,產生了過量ROS,引起MF[11]。ROS參與了MF的發生發展過程及導致心肌重塑[12]。此種測定ROS量的方法適用于各種貼壁細胞。

3.5 NAC對AngⅡ誘導myoFbs內p-PKCα膜轉位及表達的影響

圖2 免疫化學分析（A）和定量分析（B）N-乙酰半胱氨酸對p-PKCα在血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞膜轉位及表達的影響（200×）Fig.2 NAC effect ontranslocation and expression of p-protein kinase Cα（p-PKCα）induced by AngⅡ in membrane ofmyoFbs with immunohistochemistry（A）and quantitive analysis（B）（200×）**：p＜0.01 vs.control group；*：p＜0.05 vs.AngⅡgroup.

免疫組化（圖2A）可見,褐色的深淺表明p-PKCα的表達和轉位情況,褐色越深,表明p-PKCα的表達和膜轉位越多；熒光共聚焦（圖3A）可見,綠色代表p-PKCα的表達和膜轉位,紅色代表myoFbs的胞核。綠色越深,表明p-PKCα的表達和膜轉位越明顯；利用Image-ProPlus5.0V圖像分析軟件分析圖2A和圖3A,分別得圖2B和圖3B。由以上可知：AngⅡ作用myoFbs48h后與對照組相比,p-PKCα的表達明顯增加（p＜0.01）；而NAC組卻降低了p-PKCα的表達。PKC（α,β1,β2,δ,ε和ζ）存在于成年大鼠和新生大鼠的成纖維細胞中[13]。AngⅡ可以與血管緊張素受體1（AT1）結合并激活PKC,從而引起成纖維細胞增殖[14]。有研究表明,PKCα參與MF過程[15],但目前對其在 MF過程中的作用研究甚少。PKCα涉及多種器官纖維化的過程,如腎臟和心臟[16],可能是引起其纖維化過程的必經傳導的共同通路。因此,PKCα在MF過程中的信號轉導通路中具有極其復雜的作用。正常生理情況下,未活化的PKCα只存在于胞漿中,當AngⅡ作用于體外培養的myoFbs時,可促進PKCα的活化形成p-PKCα,并大量表達在胞膜。AngⅡ是通過促進p-PKCα的表達而引起MF（圖2）。

圖3 熒光共聚焦（A）和定量分析（B）分析N-乙酰半胱氨酸對p-PKCα在血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞膜轉位及表達的影響（400×）Fig.3 NACeffectsontranslocationandexpressionofp-PKCαinducedbyAngⅡinmembraneofmyoFbswith alaserconfocalscanningmicroscope（A）andquantitativeanalysis（B）（400×）**：p＜0.001vs.controlgroup；*p＜0.01vs.AngⅡgroup.

4 結論

采用熒光免疫化學方法分析ROS在AngⅡ誘導myoFbs增殖中的作用,發現AngⅡ能夠促進myoFbs增殖并導致MF；表明ROS和p-PKCα在AngⅡ誘導myoFbs增殖并導致MF過程中發揮著重要的作用。NAC通過降低·OH的含量和抑制p-PKCα的膜轉位和表達從而抑制myoFbs的增殖和MF。此研究結果為從ROS-PKCα信號轉導途徑來治療MF和逆轉心肌重塑提供了可能的治療靶點。

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董寧.吉林大學碩士論文,2010,4：1

（Received 23 April 2015；accepted 18 August2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.30873066/C180102）and the Major State Basic Research Development Program（No.2007CB512006）

Role of Reactive Oxygen Species by Fluorescence Analysis in Proliferation of M yofibroblasts Induced by AngiotensinⅡ

WANG Li-Ying1,SU Hai-Yan2,WANG Xuan1,ZHOU Yan*1,YANG Shi-Jie31（Physiology Department ofBasic Medicine College of Beihua University,Jilin 132013,China）
2（Preventive Health Department of Tumor Hospital of Jilin Province,Changchun 130021,China）
3（Pharmocology Department of Basic Medicine College of Jilin University,Changchun 130021,China）

Fluorescence analysiswas performed to explore the role of reactive oxygen species（ROS）in the proliferation ofmyofibroblasts（myoFbs）induced by angiotensinⅡ（AngⅡ）.Primary cultures of neonatal rat myoFbswere obtained by enzymatic dissociation ofWistar rat neonates,and myoFbswere cultured under 10％ fetal bovine serum.MyoFbs of2-3 generation cultured in vitrowere used in experiments and divided into three groupswhich were treated by AngⅡ,AngⅡ +N-acetyl-L-cysteine（NAC）,and normal culture medium, respectively.MyoFbswere cultured for 12,24 and 36 h.In the experiment,the proliferation rate ofmyoFbs induced by AngⅡ under different concentrations of 3-（4,5）-dimethylthiazo（-z-yl）-3,5-diphenyletrazoliumromide（MTT）was detected,the ROS levels ofmyoFbswere detected by fluorescent probes in 2′, 7′-dichlorofluorescein fluorescence Huang Shuang acetate（DCFH-DA）,and the contents and levels of oxygen free radicals（·OH）in three groups were detected by spectrophotometry,immunocytochemical staining and fluorescence confocal.Immunocytochemical staining and fluorescence confocal analysis was used to measure membrane translocation and expression of p-protein kinase Cα（p-PKCα）.The results showed thatmyoFbs incubated with AngⅡ（10-8-10-6mol/L）for 24 h increased the proliferation rate（the value ofη（％）was 170.15）and ROS,especially the content of·OH（94.53±1.68）reached the highest level.The immunocytochemistry,confocal fluorescence staining and image analysis result showed that AngⅡ could increase the translocation and expression of p-PKCαin membrane（p＜0.001 vs control group）；NAC could inhibit the proliferation of myoFbs induced by AngⅡ （the value ofη（％）was 117.05）,decrease the content of ROS and the levels of·OH（75.57±1.48）,and inhibit the translocation and expression of p-PKCαin membrane.

N-Acetyl-L-cysteine；AngiotensinⅡ；Oxygen free racical；Myofibroblasts；Protein kinase Cα；Reactive oxygen species

10.11895/j.issn.0253-3820.150331

2015-04-23收稿；2015-08-18接受

本文系973重大基礎研究基金資助課題（No.2007CB512006）,國家自然科學基金項目 （No.30873066/C180102）,博士啟動基金（No.199500033）,吉林市科技計劃項目（No.201536058）資助

E-mail：ly741023@126.com