探討重組人促紅細胞生成素改善血管性癡呆大鼠認知功能的可能機制

楊清潔 ，郭軍紅

探討重組人促紅細胞生成素改善血管性癡呆大鼠認知功能的可能機制

楊清潔1，郭軍紅2

目的 研究重組人促紅細胞生成素(rhEPO)改善血管性癡呆大鼠認知功能的可能作用機制。方法 將30只清潔級雄性SD大鼠，經(jīng)Morris水迷宮篩選合格后，隨機分為5組：假手術(shù)組、2VO組、2VO+rhEPO組、2VO+rhEPO+AG490(JAK2抑制劑)組、2VO+AG490組，每組6只。結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(2VO)建立血管性癡呆模型。造模3 d后，各組分別腹腔給予AG490(5 mg/kg)或等劑量的二甲基亞砜(DMSO，AG490的溶媒)，30 min后鼻腔給予rhEPO (150 U/125 μL)或等量的生理鹽水，每周給藥1次，共8次。8周后行Morris水迷宮試驗檢測各組大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力。HE染色觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 行為學(xué)測試結(jié)果，定位航行，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期明顯縮短。2VO+rhEPO組平均逃避潛伏期明顯低于2VO組、2VO+rhEPO+AG490組、2VO+AG490組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。空間探索實驗：2VO + rhEPO組穿越平臺次數(shù)明顯高于2VO組、2VO+rhEPO+AG490組、2VO+AG490組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HE染色結(jié)果：假手術(shù)組海馬CA1區(qū)細胞排列整齊，細胞形態(tài)正常；2VO組海馬CA1區(qū)細胞排列紊亂，可見胞體萎縮，核深染，核固縮，核溶解；2VO+rhEPO組：海馬CA1區(qū)細胞排列相對整齊，細胞結(jié)構(gòu)與正常細胞接近，偶見胞體縮小；2VO+rhEPO+AG490組、2VO+AG490海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)學(xué)改變與2VO組類似。結(jié)論 經(jīng)鼻腔給予rhEPO能改善血管性癡呆性大鼠的認知功能，其作用機制可能與激活JAK2/STAT3通路有關(guān)。

血管性癡呆；促紅細胞生成素；JAK2-STAT3；AG490

長期腦灌注不足是臨床上常見的病理狀態(tài)，在老年人中由于部分血管狹窄或閉塞所引起的一種進展、動態(tài)變化的過程，隨著缺血狀態(tài)的持續(xù)最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病和血管性癡呆(vascular dementia VD)[1-3]。隨著認識的深入發(fā)現(xiàn)(EPO)不僅用于促進紅細胞的生成，而且是一種具有多種功能的營養(yǎng)因子，EPOR廣泛存在腦組織中[4]，體內(nèi)外實驗表明，腦缺血缺氧時，受低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)刺激內(nèi)源性EPO及EPOR表達增加[5]，重組人促紅細胞生素(rhEPO)是一種通過基因重組技術(shù)合成的，其氨基酸序列及生物學(xué)活性與天然EPO完全一致。Witthuhn等[5-6]研究表明，rhEPO在體外可以誘導(dǎo)酪氨酸激酶JAK2磷酸化，并在急性全腦缺血的新生大鼠模型中激活JAK2。在慢性腦缺血時，前期實驗表明[7]，rhEPO可以減少神經(jīng)元凋亡發(fā)揮神經(jīng)元保護作用，推測其機制可能與激活JAK2/STAT3通路有關(guān)，外源性給予JAK2特異性抑制劑AG490可以抑制這一神經(jīng)保護作用。故本研究通過建立血管性癡呆模型，探討rhEPO可能的神經(jīng)保護機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 30只清潔級雄性成年SD大鼠，經(jīng)Morris水迷宮篩選合格后，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為5組：假手術(shù)組、2VO組、2VO+rhEPO組、2VO+rhEPO+AG490組、2VO+AG490組，每組6只。血管性癡呆模型的建立參照相關(guān)文獻造模[4]。

1.2 鼻腔給藥 按照文獻方法鼻腔給藥法[4]。10%水合氯醛將大鼠麻醉，仰臥固定于立體定位儀上，將頭部后仰70℃。用聚氯乙烯軟管(外徑1.0 mm，內(nèi)徑0.5 mm)插入大鼠鼻孔約2 cm，軟管外端接1 mL注射器，約半小時內(nèi)將150 U/125 μL rhEPO緩慢地交替推入大鼠的鼻孔，給藥完畢后拔除軟管，保持以上姿勢 30 min，以免藥物流失。

1.3 測試指標(biāo) Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶功能測評。定位航行實驗測量大鼠學(xué)習(xí)能力。空間探索實驗測量大鼠保存記憶的能力。 腦組織切片，腦組織HE染色。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果

2.1.1 定位航行實驗 逃避潛伏期數(shù)值越小提示大鼠學(xué)習(xí)能力越強。造模前5組大鼠平均逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，造模后假手術(shù)組與其余4組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而余4組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示造模成功。用藥結(jié)束后2VO+rhEPO組逃避潛伏期明顯低于2VO組、2VO+rhEPO+AG490組、2VO+AG490組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2VO+rhEPO組、2VO+rhEPO+AG490組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，2VO+rhEPO組與假手術(shù)組相比平均逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

表1 5組大鼠逃避潛伏期組間多重比較

2.1.2 空間探索實驗 該實驗撤除平臺后，以大鼠穿越原平臺位置的次數(shù)判斷記憶能力，穿越次數(shù)越多記憶能力越好。2VO+rhEPO組穿越平臺次數(shù)明顯多于2VO組、2VO+rhEPO+AG490組、2VO+AG490組，

且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，2VO+rhEPO組、2VO+rhEPO+AG490組穿越平臺次數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 5組大鼠的空間探索實驗結(jié)果(±s)

2.3 病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果光學(xué)顯微鏡觀察HE病理切片細胞形態(tài)學(xué)變化，假手術(shù)組：海馬CA1區(qū)神經(jīng)元呈圓形、橢圓形，排列基本整齊，細胞數(shù)量較多，核漿比值大，核仁明顯；2VO+rhEPO組：海馬CA1區(qū)細胞排列尚整齊，胞體形態(tài)大多呈圓形、橢圓形，細胞數(shù)量較多，偶見少量細胞胞體變小，胞質(zhì)深染，核固縮，核深染，核溶解；2VO組：海馬CA1區(qū)細胞排列稀疏、紊亂，神經(jīng)元細胞較正常組較少，胞體明顯縮小，部分胞核固縮，核深染，核仁消失；2VO+rhEPO+AG490組：海馬CA1區(qū)的細胞排列紊亂，可見部分胞體變小，胞核固縮，核仁消失，胞漿稀疏；2VO+AG490組：海馬CA1區(qū)的細胞稀疏，排列紊亂，胞體變小，胞核固縮，可見核仁消失，胞漿深染，細胞改變與2VO組相似。

3 討 論

3.1 rhEPO在腦血管病中的研究現(xiàn)狀 rhEPO對急性腦缺血有神經(jīng)保護作用，而關(guān)于rhEPO在長期腦缺血中的作用研究尚少。周彥慧等[7]研究表明，rhEPO對長期腦缺血大鼠中具有神經(jīng)保護作用，但其具體作用機制尚不清楚。推測鼻腔給予rhEPO誘導(dǎo)STAT3的激活，伴隨著相關(guān)抗凋亡因子bcl-2、bcl-xl表達的上調(diào)和凋亡細胞的減少，AG490通過抑制rhEPO誘導(dǎo)的STAT3激活上游因子JAK活化，伴隨著bcl-2、bcl-xl表達的下調(diào)和Caspase-3，Bax表達的上調(diào)最終起到促凋亡作用。本實驗意在證實rhEPO是長期腦灌注不足大鼠神經(jīng)保護可能的機制之一，并采用JAK/STAT通路特異性抑制劑AG490進行干預(yù)，觀察rhEPO改善長期腦灌注不足大鼠認知功能是否與激活JAK/STAT通路有關(guān)。

3.2 海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)變化 海馬直接參與信息的貯存和處理，海馬神經(jīng)元的存活數(shù)量能直接反映海馬對信息的處理、加工和儲存能力[8]。各種研究發(fā)現(xiàn)血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存在不同程度的凋亡現(xiàn)象，提示海馬神經(jīng)元的丟失可能是血管性癡呆發(fā)生的病理基礎(chǔ)[9]。本次實驗HE病理切片染色示：2VO+rhEPO組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列相對整齊，形態(tài)接近正常，細胞數(shù)量較多，2VO組海馬CA1區(qū)細胞排列疏松、紊亂，細胞數(shù)量較少，可見部分胞體萎縮，核深染，核固縮，核深染；2VO+rhEPO+AG490組、2VO+AG490組海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)與2VO組相近；說明鼻腔給予rhEPO能改善長期腦灌注不足大鼠的細胞形態(tài)學(xué)變化，可能與激活JAK2/STAT3通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用有關(guān)，且其作用可以被AG490抑制。

3.3 認知功能判斷的實驗選擇 Morris水迷宮實驗是經(jīng)典的檢測動物行為學(xué)實驗之一，2014年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎發(fā)現(xiàn)了人腦中的“內(nèi)置GPS( global positioning system)”定位系統(tǒng)，即大腦海馬區(qū)中存在一類錐體神經(jīng)元即位置細胞(Place ceU)。當(dāng)動物行走到某個特定位置時，相對應(yīng)的一些特定Place cell激活，當(dāng)行走到另一位置時，又有相應(yīng)的其他Place cell激活，這使大腦能夠?qū)⑻囟ǖ男畔⑴c相應(yīng)空間位置聯(lián)系起來，即形成了空間位置記憶。在大腦的內(nèi)嗅皮質(zhì)存在另一關(guān)鍵組成細胞即網(wǎng)格細胞(Grid cell) ，正是Grid cell將空間位置進行相應(yīng)的坐標(biāo)標(biāo)記，才實現(xiàn)動物的精確定位及路徑尋找，實現(xiàn)內(nèi)置GPS的功能[10]。因此，更加肯定了本實驗采用Morris水迷宮行為學(xué)檢測大鼠的認知功能。在此實驗中，定位航行實驗結(jié)果提示鼻腔給予rhEPO可改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)能力，其效果可以被阻斷劑AG490阻斷。空間探索實驗結(jié)果提示鼻腔給予rhEPO可能改善長期腦灌注不足大鼠的記憶能力，其效果可以被阻斷劑AG490抑制。

本研究結(jié)果證實，rhEPO可以改善長期腦灌注不足大鼠認知功能，其機制可能是通過激活JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑減少神經(jīng)元的凋亡來實現(xiàn)的，后期需要探討rhEPO給藥劑量及腦缺血不同時間點研究JAK2/STAT3通路的激活情況。

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(本文編輯 王雅潔)

The Possible Mechanism of Recombinant Human Erythropoietin Improving the Cognitive Function in Rats with Vascular Dementia

Yang Qingjie，Guo Junhong The First Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Corresponding Author：Guo Junhong

Objective To investigate the possible mechanism of recombinant human erythropoietin (rhEPO) to improve the cognitive function in rats with vascular dementia.Methods By Morris water maze qualified after screening，thiry clean male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into five groups：Sham group， group 2(2VO group)， group 3(2VO+rhEPO group)，group 42VO+rhEPO+AG490(Janus kinase 2 inhibitor)group and group 5(2VO+AG490 group).Six rats were in each group.The bilateral occlusion of common carotid arteries in SD rats was adopted to established the vascular dementia model.Rats respectively were disposed by intraperitoneal injection of AG490(5 mg/kg) or the same quantity of DMSO-AG490 solvent after chronic ischemia for 3 days.After 30 minutes，rats respectively undergone intranasal delivery rhEPO at the dose of 150 U/125 μL or equivalent volume of saline at the sametime and administered once a week for a total of eight times.After the 8 weeks ， the Morris water maze was explored to observed the spatial learning and memory capability.Morphology changes of hippocampal CA1 nerve cells were observed by Hematoxylin-Eosin (HE) staining.Results Behavioral tests results showed that the mean escape latency， with the increase of training days，was significantly shortened in rats.The average escape latency period in group 3 was lower than that in group 2，group 4 and group 5(P<0.05).The number of cross -platform in group 3 was obviously higher than that in group 2，group 4，group 5(P<0.05).HE staining showed that cells were ordered in the hippocampal CA1 area and with normal cells form in Sham group.The cells of hippocampal CA1 area were disordered and the cell body contraction， nuclear hyperchromatic， nucleus pycnosis and nuclear dissolved could be visible in group2.The cells of hippocampal CA1 area arranged neatly and the cell structure closed to normal cells，a few of contractible cells could be seen occasionally in group 3.The morphological changes of hippocampal CA1 area in group 4 and group 5 were similar to group2.Conclusion The rhEPO could improve the cognitive function in rats with vascular dementia，its mechanism may be related to activation of JAK2-STAT3 pathway.

AG490；vascular dementia；erythropoietin；JAK2-STAT3

山西省科技廳科技攻關(guān)項目(No.2013011057-2)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院碩士研究生(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

郭軍紅，E-mail： neuroguo@163.com

R256

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.008

1672-1349(2015)17-1940-04

2015-04-23)