多西他賽、培美曲塞聯合鹽酸埃克替尼不同序貫用藥時序及選擇合理用藥時機對非小細胞肺癌細胞的體外抑制作用

郭 磊，汪進良，錢海利，王海娟，胡 毅（．解放軍總醫院腫瘤內一科，北京 00853；．中國醫學科學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 000）

多西他賽、培美曲塞聯合鹽酸埃克替尼不同序貫用藥時序及選擇合理用藥時機對非小細胞肺癌細胞的體外抑制作用

郭 磊1，汪進良1，錢海利2，王海娟2，胡 毅1（1．解放軍總醫院腫瘤內一科，北京 100853；2．中國醫學科學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021）

目的：探討鹽酸埃克替尼聯合化療藥（多西他賽、培美曲塞）以不同次序序貫及選擇合理用藥時機用藥對非小細胞肺癌細胞系GLC-82的作用。方法：運用xCELLigence系統檢測多西他賽、培美曲塞、鹽酸埃克替尼單藥作用GLC-82的IC50，及單藥在GLC-82細胞內的時間依賴性IC50，并檢測鹽酸埃克替尼不同次序聯合多西他賽、培美曲塞對GLC-82的增殖毒性，用流式細胞儀檢測埃克替尼與二者聯合的不同次序對GLC-82細胞的細胞周期影響。結果：多西他賽、培美曲塞在作用36 h后在細胞內達到平衡期，而埃克替尼在作用60 h后在細胞內達到平衡期。多西他賽作用于GLC-82細胞系36 h的IC50為25 mg·mL-1，培美曲塞作用于GLC-82細胞系36 h的IC50為560 μmol·L-1，埃克替尼作用于GLC-82細胞系60 h的IC50為10 μmo·L-1。先用多西他賽或培美曲塞后用埃克替尼方案與其他用藥方案相比，細胞倍增時間顯著增加：D-I組倍增時間為（– 829.1±46.9） h；P-I組倍增時間為（– 342.0±3.4） h，與其他序貫聯合方式相比，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）；并可使細胞阻滯在G2/M期（培美曲塞阻滯在S期），細胞生長抑制效果更好（P ＜ 0.05）。結論：先于埃克替尼使用多西他賽或培美曲塞，并且選擇合理的用藥時機為體外抑制NSCLC細胞增殖的最佳聯用方案。

埃克替尼；多西他賽；培美曲塞；肺癌；序貫用藥

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，死亡率高，生存期短，是目前發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1-3]。化療和針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的靶向治療是針對晚期非小細胞肺癌（non-small cell lungcancer，NSCLC）的兩大主要治療手段。然而化療藥物的非選擇性和劑量依賴性的特點，導致其毒副反應大，且療效受限，因此研發高效低毒的新型藥物及有效配方是目前治療晚期肺癌的關鍵所在[4]。近幾年以EGFR為靶點的分子靶向治療在NSCLC的治療中日漸突出，鹽酸埃克替尼（icotinib hydrochloride，凱美納）是由浙江貝達藥業有限公司自主研發的以EGFR酪氨酸激酶為靶點的小分子靶向抗癌新藥，是一種高效特異性的表皮細胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）[5-7]。本研究通過觀察鹽酸埃克替尼與化療藥物（多西他賽、培美曲塞）的單藥、聯合序貫不同給藥方式對人肺腺癌細胞株GLC-82的增殖抑制作用，探討分子靶向藥物聯合化療治療晚期肺癌的合理用藥時機，為臨床NSCLC的綜合治療提供參考。

1 材料

1.1 細胞系

人肺腺癌細胞系GLC-82由中國醫學科學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室凍存提供。

1.2 藥物

鹽酸埃克替尼（i c o t i n i b，凱美納，批號H20110061）由浙江貝達藥業有限公司惠贈；多西他賽（docetaxel，DTX，泰索帝，批號H20090493）由賽諾菲公司惠贈；培美曲塞（pemetrexed，PEM，力比泰，批號H20100060）由美國禮來公司惠贈。

1.3 試劑

RPMI-1640培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；磷酸鹽緩沖液PBS（美國Hyclone公司）；SCR005 Accutaes酶（Millipore公司）；DAPI染液（上海碧云天生物技術有限公司）；Triton-X100（上海化學試劑公司）；miRNaseA（天根生化科技北京有限公司）。

1.4 儀器與設備

MC0-15AC二氧化碳恒溫培養箱（SANYO公司）；流式細胞儀購自美國BD公司；E-Plate L8細胞增殖培養板（瑞士Roche公司）；普通顯微鏡（日本Olympus公司）；Class Ⅱ Type A/B3超凈工作臺（Baker公司）。

實時細胞分析儀（Real-time cell analyzer，RTCA，xCELLigence檢測系統，瑞士Roche公司）：系統主要由分析檢測器、裝置工作站和放置細胞培養板的微電極平臺三部分組成，其主要通過檢測細胞的阻抗值并計算細胞指數（cell index，CI）來衡量細胞數的多少。CI計算公式：

（Zi是實驗過程中每次檢測細胞時的電阻，Z0是開始檢測的基準電阻）。

2 方法

2.1 細胞培養

人肺腺癌細胞GLC-82常規培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，于體積分數為5% CO2、37 ℃飽和濕度的孵育箱內傳代培養，胰酶消化傳代，2 ～ 3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 檢測細胞EGFR基因突變情況

抽提基因組DNA；PCR法擴增目的基因；瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增結果，樣品送諾賽基因公司進行測序。

2.3 藥物準備

將埃克替尼溶于100% DMSO中，配制成5×104μmol·L-1的母液；多西他賽原液溶于溶劑中，配制成4 mg·mL-1的母液；稱取一定質量的培美曲塞，溶于0.9%氯化鈉溶液中，配制成8×104μmol·L-1的母液，使用時均用RPMI-1640培養液稀釋至所需濃度。

2.4 細胞增殖檢測

采用含有微陣列檢測電極的細胞增殖培養板E-Plate L8（8孔板）培養細胞。在8孔板的孔中加入150 μL含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，將8孔板放到RTCA上，RTCA系統會自動進行掃描，檢查其接觸良好后開始檢測基線。取出8孔板，在孔中加入300 μL混合均勻的GLC-82細胞懸液；超凈臺中室溫放置30 min后將8孔板放到培養箱中的RTCA上，進行細胞增殖的實時動態檢測96 h。每15 min檢測一次CI，記錄細胞生長情況，根據CI值繪制曲線。

2.5 分組

根據藥物在細胞內的時間依賴性IC50共分11組：單藥埃克替尼96 h（I組），單藥培美曲塞96 h（P組），單藥多西他賽96 h（D組），埃克替尼、培美曲塞同時給藥96 h（I+P組），埃克替尼、多西他賽同時給藥96 h（I+D組），先用埃克替尼60 h后用培美曲塞36 h（I-P組），先用培美曲塞36 h后用埃克替尼60 h（P-I組），先用埃克替尼60 h后用多西他賽36 h（I-D組），先用多西他賽36 h后用埃克替尼60 h（D-I組），陰性對照96 h及空白對照96 h。

2.6 單藥細胞毒性檢測

在8孔板的孔中加入150 μL細胞懸液，進行基線測量后，每隔15 min檢測一次CI，根據CI值選擇最佳加藥時間。在8孔板中加入不同濃度藥物之后，每隔15 min檢測一次，根據CI值繪制曲線。

2.7 聯合用藥細胞毒性檢測

在8孔板的孔中加入150 μL細胞懸液，進行基線測量后，每隔15 min檢測一次CI，記錄細胞生長過程。按分組要求在同時或序貫加入兩種固定濃度藥物之后，每隔15 min檢測一次，觀察藥物作用，根據CI值繪制曲線。

2.8 流式細胞技術檢測細胞周期

按不同給藥方式處理后的細胞培養皿置于37 ℃，5% CO2培養箱中繼續培養。根據實驗分組安排，一定時間后用胰酶消化收集細胞。用PBS洗滌細胞2次（離心800 r·min-1，3 ～ 5 min），收集皿中細胞。加入1 mL 70% ～ 75%酒精固定細胞，于– 20 ℃冰箱中過夜。上機檢測前按照說明書加入配制好的300 ～ 500 μL PI染液并混勻，室溫、避光、反應10 ～ 15 min后流式細胞儀檢測PI熒光強度（激發波長480 nm，吸收波長630 nm），檢測細胞周期分布情況，計算細胞凋亡百分比，實驗重復3次。

2.9 統計學處理

實驗數據以平均數±標準差（x±s ）表示，采用SPSS19.0統計分析軟件進行分析，組間差異采用單因素方差分析，P ＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 GLC-82細胞EGFR基因突變情況

對人肺腺癌GLC-82細胞系的EGFR基因第18、19、20、21外顯子進行突變檢測，結果顯示：樣本均與陰性對照一致，無突變，GLC-82細胞EGFR基因為野生型。

3.2 細胞增殖檢測

取對數生長期細胞，于E-Plate L8每個孔中加入不同濃度的GLC-82細胞懸液（8×104個/孔、6×104個/孔、4×104個/孔、2×104個/孔），xCELLigence系統動態檢測。結果顯示正常培養的人肺腺癌GLC-82細胞第2天進入對數生長期，CI值呈時間依賴性增加，細胞懸液濃度越大，其達到對數生長期和平臺期的時間就越短。

3.3 單藥細胞毒性及藥物代謝檢測

取對數生長期細胞，于E-Plate L8每個孔中加入8×104個/孔的GLC-82細胞懸液，細胞貼壁后加入不同濃度化療藥物（如表1所示），利用iCELLigence DA Software 1.0擬合得出每種藥物的IC50，并檢測各單藥在細胞體內的時間依賴性IC50。結果顯示：藥物按不同濃度梯度作用于細胞后，細胞存活率與藥物的濃度相關，隨著藥物濃度的提高，細胞存活率逐漸降低。多西他賽和培美曲塞在細胞內36 h達到穩定期，埃克替尼在60 h達到穩定期（圖1）。多西他賽作用于GLC-82細胞系36 h的IC50為25 mg·mL-1，埃克替尼作用于GLC-82細胞系60 h的IC50為10 μmol·L-1，培美曲塞作用于GLC-82細胞系36 h的IC50為560 μmol·L-1。

表1 不同單藥加藥組濃度設置Tab 1 Different concentrations of every single drug

圖1 多西他賽、培美曲塞、埃克替尼單藥達到穩定期的時間A – 多西他賽，B – 培美曲塞，C – 埃克替尼Fig 1 The steady state time of docetaxel, pemetrexed and icotinibA – docetaxel, B – pemetrexed, C – icotinib

3.4 聯合用藥細胞毒性檢測

取對數生長期細胞，于E-Plate L8每個孔中加入8×104個/孔的GLC-82細胞懸液，待細胞貼壁后，按照分組要求同時或序貫加入各化療藥物的IC50，后繼續動態監測CI值，結果如圖所示（見圖2）。對各組CI值進行分析得出各加藥組GLC-82細胞的倍增時間（表2）。在增殖毒性方面，各序貫處理組方差分析顯示差異有統計學意義（P ＜ 0．05），D-I序貫方式優于I-D和I+D，P-I序貫方式優于I-P和I+P；細胞倍增時間更長，生長抑制作用更明顯，差異具有統計學意義（P ＜ 0．05）。

圖2 多西他賽、培美曲塞和埃克替尼單獨或聯合應用對GLC-82細胞的增殖毒性檢測A – 多西他賽和埃克替尼單獨或聯合應用；B – 培美曲塞和埃克替尼單獨或聯合應用Fig 2 The reproduction toxicity test of GLC-82 cells in different groupsA – icotinib alone or in combination with docetaxel; B – icotinib alone or in combination with pemetrexed

表2 各組處理后GLC-82細胞的倍增時間Tab 2 The doubling time of GLC-82 cells in different groups

3.5 聯合用藥對GLC-82細胞周期的影響

D-I給藥方式主要將細胞阻滯于G2/M期；P-I給藥方式主要將細胞阻滯于S期；I-D、I-P的給藥方式主要將細胞阻滯于G0/G1期；I+D組和I+P組G0/G1期細胞比例較高，各組與對照組相比差異有統計學意義（P ＜0.05）。各組細胞周期細胞比例詳見表3。

4 討論

本研究結果顯示，人肺腺癌細胞株GLC-82為EGFR野生型，多西他賽、培美曲塞和埃克替尼在一定濃度范圍內均呈濃度依賴性抑制GLC-82細胞增殖。本實驗選用EGFR野生型GLC-82細胞來進行研究，主要是考慮到：（1）既往發現化療序貫EGFR-TKIs具協同增效作用的基礎研究是來自EGFR野生型NSCLC細胞，臨床研究來自EGFR突變狀態未篩選的NSCLC患者；（2）EGFR-TKI對EGFR突變型細胞具有很強的殺傷效力。楊新杰等[8]分析了埃克替尼一線治療晚期NSCLC的近期療效和毒副反應，發現對于EGFR突變陽性患者有效率更高。化療和EGFR-TKI合理聯合應用對敏感性較差的EGFR野生型患者意義尤為重要。

表3 聯合用藥后各組GLC-82細胞的周期分布.%，x ± sTab 3 The cell cycle of GLC-82 in different groups.%,x± s

本研究結果顯示，先用多西他賽后序貫應用埃克替尼對細胞的生長抑制作用較多西他賽單藥、埃克替尼單藥、二者同時應用或先埃克替尼后序貫多西他賽明顯；先用培美曲塞后序貫應用埃克替尼對細胞的生長抑制作用較培美曲塞單藥、埃克替尼單藥、二者同時應用或先埃克替尼后序貫培美曲塞明顯，具協同增效作用。INTACT1、INTACT2、TRIBUTE和TALENT的多中心隨機對照臨床研究[9-10]也證實：對于EGFR突變狀態未知的晚期NSCLC患者，化療與EGFR-TKI同時應用未優于單獨化療。先化療再序貫EGFR-TKI能夠提高有效率，延長無進展生存期及肺腺癌患者總生存期[11-13]。并且，有研究顯示化療后EGFR-TKIs靶向藥物維持治療可使PFS延長[11]。本研究結果顯示，多西他賽或培美曲塞與埃克替尼以不同時序聯合應用均可抑制GLC-82細胞增殖，促進凋亡，作用強度與應用次序有關。多西他賽或培美曲塞先于埃克替尼給藥方案有更長的倍增時間和較好的細胞生長抑制作用。

鹽酸埃克替尼是一種高效特異性的EGFR-TKI，如果埃克替尼靶向治療之后給予化療或者與化療同時聯合，則會誘導腫瘤細胞停滯于G0/G1期，使化療效果大大降低。如果埃克替尼靶向治療之前給予化療，則會誘導腫瘤EGFR的過量表達，信號轉導增強，使后續靶向治療的靶向性更強，抑制效果更好。由于本實驗是在體外進行的細胞學實驗，與體內細胞學實驗存在一定差異，而且NSCLC是一組具有明顯異質性的疾病，因此有必要進一步探討多種EGFR野生型細胞體內外實驗研究，以進一步明確藥物作用機制、聯合用藥時序。

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Inhibiting effects of icotinib combined with docetaxel or pemetrexed on NSCLC cells in vitro in different sequential therapies and therapy timings

GUO Lei1, WANG Jin-liang1, QIAN Hai-li2, WANG Hai-juan2, HU Yi1(1. Medical Oncology Department Ⅰof PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. State Key Laboratory of Molecular Oncology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China)

Objective:To investigate the effects of icotinib combined with chemotherapy drugs (docetaxel or pemetrexed) in different sequential therapies and therapy timings on non-small-cell lung cancer cell line GLC-82.Methods:The IC50of docetaxel, pemetrexed and icotinib on GLC-82 and time dependence of each agent were analyzed by xCELLigence system. The proliferations of GLC-82 were compared in different sequential therapies of icotinib combined with docetaxel or pemetrexed. Cell cycle distribution of GLC-82 was measured by flow cytometer for evaluating different sequential therapies, and the cell survival was analyzed by xCELLigence system.Results:At the time of 36 h, docetaxel and pemetrexed reached their balance periods in cells, while icotinib reached its balance period at the time of 60 h. The IC50of docetaxel and pemetrexed on GLC-82 cell line for 36 hours were 25 mg·mL-1and 560 μmol·L-1, respectively; the IC50of icotinib on GLC-82 cell line for 60 hours was 10 μmol·L-1. Compared with the other groups, the doubling time of GLC-82 increased significantly in sequential administration of docetaxel or pemetrexed followed by icotinib groups (P ＜ 0.05). The doubling times of GLC-82 in the D-I group and P-I group were (– 829.1 ± 46.9) h and (– 342.0 ± 3.4) h, respectively. D-I group induced G2/M phase arrest and P-I group induced S phase arrest. These two kinds of administrations had better inhibiting effects on cell growth (P ＜ 0.05).Conclusion:Sequential administration of docetaxel or pemetrexed followed by icotinib at a reasonable time is the optimal combination schedule for the antiproliferative effects of NSCLC cells in vitro.

Icotinib; Docetaxel; Pemetrexed; Lung cancer; Sequential therapy

R965

A

1672 – 8157(2015)03 – 0147 – 05

2015-03-01

2015-04-21）

中國老年學學會課題（CGOS-03-2014-1-1-00500）

胡毅，男，主任醫師，研究方向：肺癌的綜合及個體化治療。E-mail：huyi0401@aliyun.com

郭磊，女，碩士研究生，醫師，研究方向：惡性腫瘤的綜合治療。E-mail：guoxiaobia@126.com