HPLC法測定人血漿中游離亞胺培南濃度

溫愛萍，李 哲，李 任，余俊先，程 晟，冀曉俊，史麗敏，段美麗（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科，北京 00050；.首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院，北京 00069；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 00050）

HPLC法測定人血漿中游離亞胺培南濃度

溫愛萍1，李 哲2，李 任1，余俊先1，程 晟1，冀曉俊3，史麗敏1，段美麗3（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100050）

目的：建立人血漿中游離亞胺培南濃度的HPLC測定方法。方法：血漿樣本經(jīng)超濾離心后，直接進樣，采用Agilent Zorbax SB-C8色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），以乙腈-0.5 mol·L-1醋酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，以頭孢他啶為內(nèi)標，紫外檢測波長為298 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果：亞胺培南在0.3 ～ 100.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r ＞0.999），質(zhì)控樣本（0.5、2.0、30.0、75.0 μg·mL-1）的方法學(xué)回收率分別為（104.54±3.17）%、（99.70±1.04）%、（98.93±1.12）%和（101.29±2.23）%；日內(nèi)精密度RSD ≤ 3.03%，日間精密度RSD ≤ 5.11%。結(jié)論：本方法準確度高、靈敏度好、操作便捷，符合亞胺培南血藥濃度監(jiān)測和藥代動力學(xué)研究的要求。

游離亞胺培南；HPLC；血漿；超濾

亞胺培南為碳青霉烯類藥物，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、對多種β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定的特點，主要用于多重耐藥的革蘭陰性桿菌感染、嚴重需氧菌與厭氧菌混合感染的治療以及病原未查明的嚴重感染[1]，是重癥感染患者常用的抗感染藥物之一。重癥感染患者的病理生理情況特殊，可能直接影響亞胺培南的體內(nèi)過程，如根據(jù)常規(guī)方案給藥可能因血藥濃度過高或過低而導(dǎo)致不良反應(yīng)或治療失敗[2-8]，因此對重癥感染患者進行亞胺培南的治療藥物監(jiān)測，可為臨床制定合理的給藥方案提供參考依據(jù)[6，9-11]。目前，國內(nèi)外亞胺培南血藥濃度的測定方法主要有親水作用色譜-質(zhì)譜檢測法[12-13]和HPLC-紫外檢測法[14-22]，質(zhì)譜檢測法對儀器要求高，難以普及；多數(shù)HPLC-紫外檢測法文獻測定的是血漿中亞胺培南的總濃度[14-17，20-22]，而血中的游離藥物是產(chǎn)生藥理效應(yīng)的部分，也只有游離藥物才能被機體轉(zhuǎn)化和排泄，因此測定游離藥物濃度更具有臨床意義[23]。本研究建立人血漿中游離亞胺培南濃度的高效液相色譜測定方法，以期為考察亞胺培南在重癥感染患者的藥動學(xué)方面提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)（美國Agilent公司）；分析天平（德國Sartorius集團）；離心機（德國Eppendorf公司）；Amicon超濾管（0.5 mL，3 KD，美國Millipore公司）；Milli-Q plus超純水器（美國Millipore公司）。

注射用亞胺培南西司他丁（亞胺培南500 mg/西司他丁500 mg，美國默沙東公司）；USP亞胺培南對照品（純度93.2%，國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司，批號I1K226）；內(nèi)標頭孢他啶（純度84.2%，中國藥品生物制品檢定所，批號130484-200803）。乙腈，甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙酸銨、氫氧化鈉（NaOH）、3-（N-嗎啉基）丙磺酸（MOPS）均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C8柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動相：乙腈和0.5 mol·L-1醋酸銨緩沖液（pH 6.8），以梯度方式洗脫（初始乙腈2%，經(jīng)5 min按比例增至40%，再經(jīng)5 min按比例減至2%），流速：1.0 mL·min-1；紫外檢測波長：298 nm。

2.2 穩(wěn)定液的配制

稱取MOPS 2.64 g，用100 mL超純水溶解，加入適量NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.8。

2.3 儲備液的配制

分別精密稱取亞胺培南和內(nèi)標頭孢他啶對照品置于容量瓶中，加入穩(wěn)定液配制成1 mg·mL-1的亞胺培南和500 μg·mL-1的頭孢他啶儲備液，分裝后，– 70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣本處理

精密吸取血漿樣本與穩(wěn)定液混合液（1∶1，200 μL），加入內(nèi)標頭孢他啶儲備液20 μL，渦旋混勻，移入超濾管中，離心（13 000 r·min-1，10 min），吸取超濾液，50 μL進樣，記錄色譜圖。在本實驗條件下，亞胺培南和內(nèi)標頭孢他啶分離良好，不受血漿色譜峰的干擾，見圖1。危重癥患者常用的萬古霉素、利奈唑胺、伏立康唑、甲硝唑、阿奇霉素、阿昔洛韋、咪達唑侖、芬太尼、丙泊酚、奧美拉唑、泮托拉唑、二羥丙茶堿、氨溴索、烏拉地爾、地爾硫卓、苯海拉明、地塞米松、異甘草酸鎂、還原型谷胱甘肽等藥物對本測定方法無顯著干擾。

2.5 標準曲線的制備

圖1 HPLC色譜圖A – 亞胺培南+頭孢他啶標準溶液，B – 空白血漿，C – 空白血漿+亞胺培南+頭孢他啶，D – 受試者血漿樣本；1 – 亞胺培南，2 – 頭孢他啶Fig 1 HPLC chromatogramsA – imipenem and ceftazidime standard solution, B – blank human plasma, C – blank plasma vortex with imipenem and ceftazidime, D –patient's plasma samples; 1 – imipenem, 2 – ceftazidime

以穩(wěn)定液和亞胺培南儲備液分別配制質(zhì)量濃度為0.3、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg·mL-1的標準曲線溶液，測定當天，加入等比例空白血漿，按照“2.4”項下方法處理血漿樣本后進樣分析。以樣本峰面積與內(nèi)標峰面積之比為橫坐標，血漿藥物濃度為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法（W = 1/C2）進行回歸計算，求得標準曲線回歸方程為：Y = 0.0334 X + 0.0010（r = 0.999 6），整個測定過程中相關(guān)系數(shù)在0.999 0 ～1.000 0之間。

2.6 準確度和精密度

另以穩(wěn)定液和亞胺培南儲備液分別配制質(zhì)量濃度為0.5、2.0、30.0、75.0 μg·mL-1的質(zhì)控溶液。分別取5份質(zhì)控溶液樣品各100 μL，測定當天，加入等比例空白血漿，按照“2.4”項下方法處理后進樣分析，連續(xù)測定5 d，以實測濃度和真實濃度的比值計算相對回收率，反映方法學(xué)準確度；以日內(nèi)和日間實測濃度的RSD反映方法學(xué)精密度。結(jié)果見表1。

表1 亞胺培南測定方法的精密度和準確度.n= 5Tab 1 Precision and accuracy of determination method of imipenem.n= 5

2.7 提取回收率

分別取3份低、中、高濃度（2.0、30.0、75.0 μg·mL-1）的亞胺培南質(zhì)控溶液樣本各100 μL，測定當天，加入等比例空白血漿，按照“2.4”項下方法處理血漿樣本后進樣分析，以血漿稀釋質(zhì)控溶液樣本的峰面積與同濃度的質(zhì)控溶液樣本經(jīng)同倍數(shù)穩(wěn)定液稀釋后直接進樣的峰面積比值計算提取回收率，結(jié)果分別為（98.23±0.35）%，（96.83±1.61）%和（97.22± 2.23）%。

2.8 穩(wěn)定性

分別取50 μL亞胺培南和頭孢他啶儲備液，加入900 μL穩(wěn)定液，渦旋混合后，50 μL進樣分析，考察儲備液長期放置95 d（n = 3）及室溫放置6 h（n = 3）穩(wěn)定性；取低、中、高3個濃度（2.0、30.0、75.0 μg·mL-1）的亞胺培南質(zhì)控溶液樣本，加入等比例空白血漿，考察反復(fù)凍融3次、室溫放置6 h（n = 3）、– 70 ℃放置3個月（n = 3）及自動進樣器放置6 h（n = 3）的穩(wěn)定性。另外，將受試者血樣（n = 3）分為兩份，一份立即離心（3000 r·min-1，10 min），分離血漿，加入等比例穩(wěn)定液，按照“2.4”項下方法處理血漿樣本后進樣分析；另一份放置于4 ℃冰盒中，2 h后進行離心，分離血漿，加入等比例穩(wěn)定液，按照“2.4”項下方法處理血漿樣本后進樣分析，考察受試者血樣4 ℃放置2 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明在上述條件下，亞胺培南穩(wěn)定性良好，儲備液RSD值均小于5%，血漿樣本RSD值均小于10%。

2.9 臨床應(yīng)用

經(jīng)北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書后，已將本方法用于4例危重癥患者游離亞胺培南血藥濃度的測定。亞胺培南西司他丁給藥方案為0.5 g（溶于100 mL 0.9%氯化鈉注射液，持續(xù)輸注1 h），每6 h給藥一次，達穩(wěn)態(tài)（連續(xù)給藥至少48 h）后于給藥前及給藥后0.5、1、1.5、2、3、4和6 h采集血液樣本，藥-時曲線見圖2。由圖可見，實測游離亞胺培南血藥濃度范圍為0.49 ～ 26.08 μg·mL-1，均在本方法的線性范圍內(nèi)。相同的給藥方案條件下，4例患者體內(nèi)的游離亞胺培南濃度存在明顯的個體差異，最高與最低峰濃度相差約4倍。

圖2 4例危重癥患者的藥-時曲線Fig 2 Concentration-time curve of 4 critically ill patients

3 討論

3.1 游離亞胺培南濃度測定方法

目前，游離藥物測定方法主要有平衡透析法、超離心法、凝膠過濾法和超濾離心法，超濾離心法簡便快捷，耗時較短，且結(jié)果穩(wěn)定、可靠，已成為游離藥物分析的首選方法[23-24]。根據(jù)文獻報道[18-19]，本研究應(yīng)用超濾離心法對血漿樣本進行處理，研究結(jié)果表明此方法提取回收率高且較為穩(wěn)定，處理時間較蛋白沉淀法短，適合于臨床患者血藥濃度的快速測定及不穩(wěn)定藥物濃度的測定。

3.2 亞胺培南血漿樣本的穩(wěn)定性

亞胺培南在血漿中極不穩(wěn)定，溶液的pH偏酸或偏堿均會加快其降解[20]。早在1986年，就有研究者考察了亞胺培南在0.9%氯化鈉注射液及人血清中的穩(wěn)定性情況[25]，研究發(fā)現(xiàn)，2 ℃、25 ℃和37 ℃條件下，亞胺培南（2.5 mg·mL-1）在0.9%氯化鈉注射液中的半衰期分別為44.42 h、6.21 h和2.05 h；20 ℃和37 ℃條件下，亞胺培南（100 μg·mL-1）在人血清中的半衰期分別為58.72 h和10.73 h。可見在測定過程中尤其需要關(guān)注亞胺培南的穩(wěn)定性情況。在亞胺培南測定相關(guān)文獻中，多在血漿樣本中加入穩(wěn)定液以提高亞胺培南測定過程中的穩(wěn)定性，以滿足測定要求。本研究以0.126 mol·L-1MOPS緩沖液（pH 6.8）作為穩(wěn)定液，根據(jù)臨床樣本測定研究需要，重點考察了儲備液長期放置及室溫放置穩(wěn)定性，血漿樣品反復(fù)凍融、室溫放置、– 70 ℃放置及自動進樣器放置穩(wěn)定性，以及受試者血樣4 ℃冰盒放置穩(wěn)定性，結(jié)果表明樣本穩(wěn)定性均可滿足測定要求。

綜上，在關(guān)注臨床療效相關(guān)性和測定樣本穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，本研究建立了人血漿中游離亞胺培南濃度的HPLC測定方法，實際應(yīng)用于4例危重癥患者亞胺培南濃度測定。結(jié)果表明本研究的樣本處理方法較為省時便捷，采血量少（僅需血漿樣本100 μL），尤其適用于兒童及危重癥患者的游離亞胺培南血藥濃度監(jiān)測和藥動學(xué)研究。

[1] 汪復(fù)，張嬰元.實用抗感染治療學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：278.

[2] Afshartous D, Bauer SR, Connor MJ, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of imipenem and meropenem in critically ill patients treated with continuous venovenous hemodialysis[J]. Am J Kidney Dis, 2014, 63(1): 170-171.

[3] Blot S, Lipman J, Roberts DM, et al. The influence of acute kidney injury on antimicrobial dosing in critically ill patients: are dose reductions always necessary?[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2014, 79(1): 77-84.

[4] Blot SI, Pea F, Lipman J. The effect of pathophysiology on pharmacokinetics in the critically ill patient — Concepts appraised by the example of antimicrobial agents[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2014, 77: 3-11.

[5] Scoville BA, Mueller BA. Medication dosing in critically ill patients with acute kidney injury treated with renal replacement therapy[J]. Am J Kidney Dis, 2013, 61(3): 490-500.

[6] Roberts JA, Abdul-Aziz MH, Lipman J, et al. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions[J]. Lancet Infect Dis, 2014, 14(6): 498-509.

[7] 張娟娟，王英，張睢揚，等.成人膿毒血癥患者不同負荷劑量的亞胺培南/西司他丁藥動學(xué)/藥效學(xué)參數(shù)差異的研究[J].中華肺部疾病雜志（電子版），2013，6（3）：210-214.

[8] Couffignal C, Pajot O, Laouenan C, et al. Population pharmacokinetics of imipenem in critically ill patients with suspected ventilator-associated pneumonia and evaluation of dosage regimens[J]. Br J Clin Pharmacol, 2014, 78(5): 1022-1034.

[9] Roberts JA, Ulldemolins M, Roberts MS, et al. Therapeutic drug monitoring of beta-lactams in critically ill patients: proof of concept[J]. Int J Antimicrob Agents, 2010, 36(4): 332-339.

[10] 董玲芳，張偉，王文義，等.亞胺培南在重癥感染患者體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究[J].中華實用診斷與治療雜志，2014，28（1）：5-7.

[11] Goncalves-Pereira J, Povoa P. Antibiotics in critically ill patients: a systematic review of the pharmacokinetics of beta-lactams[J]. Crit Care, 2011, 15(5): R206.

[12] Hu ZY, Boucher BA, Laizure SC, et al. Nonvolatile salt-free stabilizer for the quantification of polar imipenem and cilastatin in human plasma using hydrophilic interaction chromatography/ quadrupole mass spectrometry with contamination sensitive offaxis electrospray[J]. J Mass Spectrom, 2013, 48(8): 945-950.

[13] Xu Y, Xie W, Miller-Stein CM, et al. Hydrophilic interaction chromatography/tandem mass spectrometry for the simultaneous determination of three polar non-structurally related compounds, imipenem, cilastatin and an investigational beta-lactamase inhibitor, MK-4698, in biological matrices[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23(14): 2195-2205.

[14] Legrand T, Chhun S, Rey E, et al. Simultaneous determination of three carbapenem antibiotics in plasma by HPLC with ultraviolet detection[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2008, 875(2): 551-556.

[15] Dailly E, Bouquie R, Deslandes G, et al. A liquid chromatography assay for a quantification of doripenem, ertapenem, imipenem, meropenem concentrations in human plasma: application to a clinical pharmacokinetic study[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2011, 879(15-16): 1137-1142.

[16] Lopez KJ, Bertoluci DF, Vicente KM, et al. Simultaneous determination of cefepime, vancomycin and imipenem in human plasma of burn patients by high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007, 860(2): 241-245.

[17] Verdier MC, Tribut O, Tattevin P, et al. Simultaneous determination of 12 beta-lactam antibiotics in human plasma by high-performance liquid chromatography with UV detection: application to therapeutic drug monitoring[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(10): 4873-4879.

[18] Garcia-Capdevila L, Lopez-Calull C, Arroyo C, et al. Determination of imipenem in plasma by high-performance liquid chromatography for pharmacokinetic studies in patients[J]. J Chromatog B Biomed Sci Appl, 1997, 692(1): 127-132.

[19] Myers CM, Blumer JL. Determination of imipenem and cilastatin in serum by high-pressure liquid chromatography[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1984, 26(1): 78-81.

[20] 劉松青，馬文秀，代青，等.HPLC測定人血清中亞胺培南的濃度[J].中國抗生素雜志，1997，22（5）：347-350.

[21] 孔維華，鞠浩爽，王曉雪，等.HPLC測定人血漿中亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、法羅培南濃度[J].中國藥學(xué)雜志，2014，49（14）：1247-1251.

[22] 王盈盈，王陳翔，胡盧豐，等.HPLC測定人血漿中亞胺培南的濃度[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（12）：1349-1352.

[23] 李金恒，許勁秋.游離藥物測定在治療藥物監(jiān)測中的意義[J].中國藥理學(xué)通報，1999，15（1）：14-17.

[24] 張耀東，段麗芳，葉馳霞.血游離霉酚酸濃度監(jiān)測的研究進展[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2013，10（6）：352-354.

[25] Swanson DJ, DeAngelis C, Smith IL, et al. Degradation kinetics of imipenem in normal saline and in human serum[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1986, 29(5): 936-937.

Determination of free imipenem in human plasma by HPLC

WEN Ai-ping1, LI Zhe2, LI Ren1, YU Jun-xian1, CHENG Sheng1, JI Xiao-jun3, SHI Li-min1, DUAN Mei-li3(1. Department of Pharmacy, Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China; 2. School of Chemical Biology and Pharmaceutical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 3. Department of Critical Care Unit, Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China)

Objective:To establish the HPLC method for determining the concentration of free imipenem in human plasma.Methods:Prior to analysis, free imipenem was isolated from plasma samples using ultrafiltration and centrifugation. Then, the extracts were injected directly into an Agilent Zorbax SB-C8column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm). The mobile phase was consisted of acetonitrile-ammonium acetate solution (0.5 mol·L-1), and the gradient elution mode was applied in chromatographic separation. The flow rate was 1.0 mL·min-1. Ceftazidime was chosen as internal standard. The detection wavelength was set at 298 nm. The column temperature was 30 ℃.Results:The linear range of the calibration curve was 0.3 – 100.0 μg·mL-1with a good correlation coefficient (r ＞ 0.999). The average recovery rates of quality control samples (0.5, 2.0, 30.0, 75.0 μg·mL-1) were (104.54 ± 3.17)%, (99.70 ± 1.04)%, (98.93 ± 1.12)% and (101.29 ± 2.23)%, respectively. The intra-day RSD was equal to or less than 3.03%, and interday RSD was equal to or less than 5.11%.Conclusion:The method was accurate, sensitive and simple, which was suitable for the therapeutic drug monitoring and clinical pharmacokinetic study of imipenem.

Free imipenem; HPLC; Plasma; Ultrafiltration

R917

A

1672 – 8157(2015)03 – 0151 – 04

2015-01-15

2015-04-01）

溫愛萍，女，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。E-mail：wenaiping@126.com