不同粒徑TiO2顆粒對(duì)海洋微藻的毒性效應(yīng)

馬菲菲，孫雪梅，韓倩，陳碧鵑，夏斌*，曲克明

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

不同粒徑TiO2顆粒對(duì)海洋微藻的毒性效應(yīng)

馬菲菲1，孫雪梅1，韓倩1，陳碧鵑1，夏斌1*，曲克明1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

本實(shí)驗(yàn)以新月菱形藻為受試生物，研究了低濃度不同粒徑TiO2顆粒(21 nm、60 nm和400 nm)對(duì)海洋微藻生長(zhǎng)、抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT和過氧化物酶POD)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)含量的影響，并測(cè)定了相應(yīng)的活性氧自由基(ROS)的含量，初步探討了TiO2顆粒對(duì)海洋微藻的作用機(jī)制。結(jié)果表明，1 mg/L TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的抑制作用隨著粒徑的減小而逐漸增強(qiáng)，第48 h、72 h、96 h呈現(xiàn)出顯著的納米效應(yīng)。TiO2顆粒可以誘導(dǎo)藻細(xì)胞內(nèi)ROS的含量增加，對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫，新月菱形藻的抗氧化酶活性發(fā)生應(yīng)激響應(yīng)，以清除過量的ROS，但剩余的ROS對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致MDA含量升高，并且納米級(jí)TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻的氧化損傷大于微米級(jí)顆粒。在不同粒徑TiO2顆粒的脅迫下，藻細(xì)胞SOD和CAT活性的響應(yīng)也存在差異。本研究將為開展人工納米材料對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)影響的潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

TiO2；新月菱形藻；納米顆粒；海洋微藻；抗氧化酶；毒性效應(yīng)

1 引言

隨著納米科技的迅猛發(fā)展，納米材料已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在人類生產(chǎn)和生活中，同時(shí)也會(huì)不可避免的進(jìn)入到水環(huán)境中，對(duì)水生生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生潛在的影響，已引起國(guó)內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注[1—2]。納米TiO2已被工業(yè)化生產(chǎn)并大量的應(yīng)用在水質(zhì)凈化、醫(yī)藥、化妝品、食品、電子及工程制造等領(lǐng)域[3—5]。微藻是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，能為其他營(yíng)養(yǎng)級(jí)的生物提供能量和氧氣，對(duì)維護(hù)整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)平衡和能量循環(huán)起著十分重要的作用。因此，藻類毒性試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于評(píng)估有害物質(zhì)的毒性效應(yīng)[6—7]。目前國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于TiO2納米顆粒(Nanoparticles，NPs)對(duì)微藻毒性效應(yīng)的報(bào)道[8—12]，均表明TiO2NPs可以抑制浮游植物的生長(zhǎng)，并對(duì)藻細(xì)胞造成氧化損傷。但是以上研究都是針對(duì)TiO2NPs對(duì)淡水微藻的影響，而不同粒徑TiO2顆粒對(duì)海洋微藻毒性效應(yīng)的研究還未見報(bào)道。

NPs通過地表徑流，大氣沉降或人為泄漏等方式進(jìn)入到海洋環(huán)境后，會(huì)受到海水有機(jī)質(zhì)、離子強(qiáng)度和pH等水化學(xué)條件，光照、風(fēng)浪等環(huán)境因素的影響而發(fā)生一系列復(fù)雜的聚集-分散-再聚集或者分散-聚集-再分散過程[13]，所以NPs在海洋環(huán)境中的行為相比與淡水中會(huì)更加復(fù)雜，進(jìn)而會(huì)影響到NPs對(duì)海洋生物的毒性效應(yīng)及致毒機(jī)制[14—15]。新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)是一種海洋真核單細(xì)胞硅藻，因其富含蛋白質(zhì)、碳水化合物及多不飽和脂肪酸而被作為優(yōu)良餌料廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，是多種軟體動(dòng)物、甲殼類幼體和浮游動(dòng)物的主要餌料。本研究選取3種不同粒徑TiO2顆粒(21 nm、60 nm和400 nm)，分析TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)、抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的影響以及相應(yīng)的胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)含量的變化，探討不同粒徑TiO2顆粒對(duì)海洋微藻的毒性效應(yīng)，為客觀評(píng)價(jià)人工納米材料對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

新月菱形藻取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所藻種培養(yǎng)室。21 nm TiO2顆粒購(gòu)自西格瑪奧德里奇(中國(guó))有限公司，純度大于99.5%；60 nm和400 nm TiO2顆粒購(gòu)自阿拉丁試劑(中國(guó))有限公司，純度分別為大于99.8%和大于99.8%。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純或分析純。玻璃器皿在使用前均用10%濃硝酸浸泡48 h，并用蒸餾水沖洗干凈，高溫高壓(120℃，20 min)滅菌后待用。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 新月菱形藻的培養(yǎng)

將砂濾海水用0.45 μm混合纖維濾膜過濾后，置于錐形瓶中進(jìn)行高溫高壓滅菌，添加f/2[16]培養(yǎng)液后，接入新月菱形藻，放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(20±0.5)℃，光照強(qiáng)度為3 500 lx，光暗比為12 h∶12 h。

2.2.2 TiO2母液的制備

將TiO2顆粒加入到f/2培養(yǎng)液中，制備濃度為1 000 mg/L的TiO2母液，置于棕色玻璃瓶中，待用。配制試驗(yàn)液之前超聲波震蕩30 min。

2.2.3 TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響

取生長(zhǎng)狀況良好，處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的新月菱形藻加入到f/2培養(yǎng)基中，使得新月菱形藻密度為1×106cell/mL。把混合好的藻液分裝到250 mL的錐形瓶中，每瓶體積為200 mL，分別將21 nm、60 nm和400 nm TiO2母液加入到藻液中，立即搖勻，配置濃度為1 mg/L TiO2實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行，以正常培養(yǎng)的藻液(無TiO2)為對(duì)照組，然后放入光照振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h在奧林巴斯顯微鏡(AX70)下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得到藻細(xì)胞密度，以表征不同粒徑TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響。

2.2.4 TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生理指標(biāo)的影響

將新月菱形藻暴露在濃度為1 mg/L的21 nm、60 nm和400 nm TiO2實(shí)驗(yàn)組96 h后，運(yùn)用高速冷凍離心機(jī)離心(5 000 r/min，5 min)收集100 mL的藻細(xì)胞，加入2 mL新鮮培養(yǎng)液使藻細(xì)胞懸浮，將收集到的藻細(xì)胞用超聲破碎儀進(jìn)行破碎，4 000 r/min離心5 min取上清液，用于 SOD，CAT，POD活性以及MDA和ROS含量的測(cè)定，均采用南京建成科技有限公司的試劑盒完成，具體操作參照說明書進(jìn)行。其中，蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定；SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，定義每mg蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U/mg)；CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定，定義為每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的過氧化氫的量為一個(gè)活力單位(U/m)；POD活性的測(cè)定采用催化過氧化氫反應(yīng)的原理，在420 nm處測(cè)定吸光度的變化，定義在37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg底物的酶量為一個(gè)POD活力單位(U/mg)；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，單位為nmol/mg；在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm，采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)ROS含量，結(jié)果以熒光強(qiáng)度/mg表示。

2.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)，用Tukey’s test進(jìn)行各組均數(shù)的多重比較，P<0.05表示顯著差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響

不同粒徑TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響如圖1所示。第24 h時(shí)21 nm、60 nm和400 nm TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制作用，到48 h時(shí)達(dá)到最大，抑制率分別為23.88%、21.66%和7.19%，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率有所降低，到96 h時(shí)，抑制率分別為13.89%、12.68%和5.48%。第24 h時(shí)3種粒徑TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻的抑制作用沒有顯著差異(P>0.05)，隨后21 nm與60 nm TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻的抑制作用沒有顯著差異(P>0.05)，但與400 nm TiO2顆粒均具有顯著差異(P<0.05)，這表明在納米尺度范圍內(nèi)(1～100 nm)，1 mg/L的TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻的抑制作用不具有尺寸效應(yīng)，但是納米級(jí)與微米級(jí)顆粒相比具有尺寸效應(yīng)。Aruoja等[8]研究了大顆粒和納米級(jí)CuO、ZnO及TiO2對(duì)羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明大顆粒對(duì)微藻的72 h EC50值均顯著大于納米顆粒。Sadiq等[9]研究表明微米級(jí)TiO2顆粒對(duì)柵藻(Scenedesmussp.)和小球藻(Chlorellasp.)生長(zhǎng)的抑制作用要小于納米顆粒。以上研究是不同粒徑顆粒對(duì)淡水微藻生長(zhǎng)的抑制作用，但與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，均表現(xiàn)出良好的納米效應(yīng)，這表明雖然納米顆粒在海水中發(fā)生團(tuán)聚[17]，但仍有部分顆粒以納米形式存在，從而對(duì)海洋微藻產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

圖1 不同粒徑TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 The impact of TiO2 particles on N.closterium cell growth 不同字母表示不同實(shí)驗(yàn)組間呈顯著差異(P<0.05)，下同Different letters indicate significant differences among different treatments (P<0.05). The same below

3.2 TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻的ROS含量的影響

當(dāng)細(xì)胞受到外界毒物的干擾時(shí)，細(xì)胞就會(huì)處于氧化脅迫狀態(tài)使得胞內(nèi)ROS升高。在正常條件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS會(huì)被細(xì)胞的抗氧化還原系統(tǒng)清除掉，而如果細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的 ROS過多超出細(xì)胞的清除能力時(shí)，大量的ROS就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)累積從而引起細(xì)胞的氧化損傷，發(fā)生脂質(zhì)過氧化、基因損傷及細(xì)胞凋亡等[18]。

不同粒徑TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻活性氧自由基(ROS)的影響如圖2所示，新月菱形藻在1 mg/L TiO2顆粒的作用下產(chǎn)生大量的ROS，與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，21 nm和60 nm TiO2顆粒與400 nm TiO2顆粒實(shí)驗(yàn)組相比具有顯著差異(P<0.05)，這表明納米級(jí)和微米級(jí)TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻細(xì)胞ROS的影響具有顯著的尺寸效應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加，是對(duì)環(huán)境壓力的一個(gè)早期響應(yīng)[19]。已有研究證明，在納米TiO2顆粒的作用下，大腸桿菌(Escherichiacoli)[20]、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)[21]、短裸甲藻(Gymnodiniumbreve)[11]均產(chǎn)生大量ROS，與對(duì)照組呈顯著差異(P<0.05)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。所以，ROS是納米顆粒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的主導(dǎo)因素，而納米顆粒的氧化損傷機(jī)制是迄今最為普遍接受的一種納米材料致毒機(jī)制[22]。

圖2 TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻ROS的影響Fig.2 ROS level of algal cells after exposed to TiO2particles for 96 h

3.3 TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻丙二醛(MDA)含量的影響

丙二醛(MDA)是膜脂受活性氧作用產(chǎn)生的物質(zhì)，測(cè)定其含量可以評(píng)價(jià)質(zhì)膜受損程度，反映植物遭受逆境傷害的程度。MDA從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，可以與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，從而喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質(zhì)的合成。因此，MDA的積累可以對(duì)膜和細(xì)胞造成一定的傷害。

不同粒徑TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻MDA含量的影響如圖3所示，1 mg/L TiO2顆粒處理新月菱形藻后，各實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞MDA含量均增加，其中21 nm和60 nm TiO2顆粒實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比增加了近1倍，具有顯著差異(P<0.05)。400 nm TiO2顆粒實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，21 nm和60 nm TiO2顆粒實(shí)驗(yàn)組均無顯著差異(P>0.05)。在納米TiO2顆粒(21 nm和60 nm)暴露下，藻細(xì)胞ROS和MDA含量變化趨勢(shì)基本一致，也進(jìn)一步證實(shí)藻中ROS的增多導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的累積，從而使得細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化。侯東穎等研究表明在1 mg/L納米TiO2顆粒暴露下，普生輪藻(Charavulgaris)的MDA含量顯著升高，造成了膜脂質(zhì)過氧化，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[12]。在微米TiO2顆粒暴露下，藻細(xì)胞ROS含量雖然顯著高于對(duì)照組，但藻細(xì)胞MDA含量與對(duì)照組沒有顯著差異，這主要是由于藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性對(duì)脅迫發(fā)生響應(yīng)，清除了一部分ROS，剩余的ROS沒有對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化。

圖3 TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻MDA含量的影響Fig.3 MDA levels of algal cells after exposed to TiO2 particles

3.4 TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻抗氧化酶活性的影響

綜上所述，低濃度TiO2顆粒進(jìn)入海水中發(fā)生團(tuán)聚[17]，但仍有部分顆粒以納米形式存在，對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的抑制作用以及氧化損傷均呈現(xiàn)出納米效應(yīng)。在不同粒徑TiO2顆粒暴露下，海洋微藻細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激響應(yīng)，SOD和CAT活性受到顯著誘導(dǎo)或抑制，以清除過量的ROS，從而減輕藻細(xì)胞的氧化損傷。由于暴露TiO2顆粒粒徑的不同，藻細(xì)胞抗氧化酶活性響應(yīng)存在差異，這可能是由于不同粒徑TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻的作用方式有所不同，這將是我們下一步研究的重點(diǎn)，以明確不同粒徑TiO2顆粒對(duì)海洋微藻的致毒機(jī)制。

4 結(jié)論

(1)濃度為1 mg/L的TiO2顆粒(21 nm、60 nm和400 nm)對(duì)新月菱形藻的生長(zhǎng)均有抑制作用，并且在第48 h、72 h、96 h時(shí)納米級(jí)和微米級(jí)顆粒對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的抑制作用具有顯著差異，呈現(xiàn)出納米效應(yīng)。

(2)在TiO2顆粒的作用下，新月菱形藻ROS的含量增加，MDA的含量升高，且納米級(jí)的TiO2顆粒(21 nm和60 nm)對(duì)新月菱形藻的氧化損傷要大于微米級(jí)(400 nm)。

(3)在不同粒徑TiO2顆粒的脅迫下，新月菱形藻的SOD和CAT活性受到顯著誘導(dǎo)或抑制，但響應(yīng)存在差異，這可能是由于TiO2顆粒因粒徑不同對(duì)海洋微藻的作用方式有所不同。

圖4 不同粒徑TiO2顆粒對(duì)新月菱形藻抗氧化酶活性的影響Fig.4 Antioxidant enzymes activities of algal cells after exposure to TiO2 particles

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Toxic effects of TiO2particles with different size on the marine microalga

Ma Feifei1，Sun Xuemei1，Han Qian1，Chen Bijuan1，Xia Bin1，Qu Keming1

(1.KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries，MinistryofAgriculture，ShandongProvincialKeyLaboratoryofFisheryResourcesandEcologicalEnvironment，YellowSeaFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Qingdao266071，China)

With the increasing application of nanotechnologies，it is no doubt that more and more engineered nanoparticles end up in marine environment. The toxicity of TiO2particles with different sizes (21 nm，60 nm and 400 nm) to the marine microalgaNitzschiaclosteriumwas investigated in this study，including the growth inhibition and oxidative stress. The results showed that the toxicity of 1 mg/L TiO2particles toN.closteriumcells increased with the decrease of particle size，indicating significant nano-effects at 48 h，72 h and 96h exposure，respectively. TiO2particles induced excessive reactive oxygen species (ROS) which led to oxidative stress on the algal cells. The antioxidant enzyme activities ofN.closteriumcells could eliminate some ROS in order to protect algae cells. However，the rest could cause oxidative damage and increase malondialdehyde (MDA) levels concomitantly. In addition，the oxidative damage caused by nano-sized TiO2particles (21nm and 60nm) was greater than micro-sized particles. Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities of the algal cells had different response under the stress of TiO2particle with different size. This study shed new light on the assessment of ecological toxicity of engineered nanomaterials．

TiO2;Nitzschiaclosterium; nanoparticles; marine microalga; antioxidant enzyme; toxic effect

2015-01-05；

2015-07-21。

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2013A02YQ02)；國(guó)家自然科學(xué)青年基金(41206100)；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金(20603022012020)。

馬菲菲(1987-)，女，山西省運(yùn)城市人，主要從事海洋生態(tài)毒理學(xué)研究。E-mail:wuyanmf001@163.com

*通信作者：夏斌，副研究員，主要從事海洋生態(tài)毒理學(xué)研究。E-mail：xiabin@ysfri.ac.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.010

X171.5

A

0253-4193(2015)10-0100-06

馬菲菲，孫雪梅，韓倩，等. 不同粒徑TiO2顆粒對(duì)海洋微藻的毒性效應(yīng)[J].海洋學(xué)報(bào)，2015，37(10)：100—105，

Ma Feifei，Sun Xuemei，Han Qian，et al. Toxic effects of TiO2particles with different size on the marine microalga[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(10)：100—105，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.010