pH值對漆酶活化玉米秸稈木質素的影響

張 楠，邸明偉

（東北林業大學，生物質材料科學與技術教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

pH值對漆酶活化玉米秸稈木質素的影響

張 楠，邸明偉

（東北林業大學，生物質材料科學與技術教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

采用漆酶在不同pH條件下對玉米秸稈木質素進行活化處理，利用FT-IR、紫外分光光度計、GPC、TG等分析方法研究了pH值對漆酶活化木質素的影響。結果表明，漆酶會使玉米秸稈木質素發生脫甲基作用，使得酚羥基含量增加，pH為4.0時活化效果最好。漆酶對玉米秸稈木質素既有解聚作用又有聚合作用，pH值較高時綜合表現為解聚作用，pH值較低時則表現為聚合作用。

玉米秸稈木質素；活化；漆酶；pH值

1 前言

目前以植物纖維為原料的產業，如制漿造紙、木材水解、生物質煉制、生物質能源等，木質素基本上都作為廢棄物排出[1，2]，若能開發利用，可制備生物基高分子材料或者膠粘劑。同時木質素本身具有甲氧基、酚羥基、羰基、羧基和醚鍵等多種官能團和化學鍵[3，4]，具有很高的利用和改性價值。然而，工業生產中產生的木質素分子質量大、活性較低，使其應用領域受到限制，因此對木質素進行降解活化具有重要的實際意義。木質素的降解活化方法有化學法[5～8]，如加氫還原法、催化氧化法、電化學法等，還有近年來大量學者關注的生物降解方法[9，10]，其中采用漆酶對木質素進行活化降解是關注的熱點之一[11～17]。目前相關漆酶活化木質素的研究主要針對水溶性的木質素產品，而對玉米秸稈生物煉制的非水溶性木質素副產品鮮有涉及，而這類木質素副產物由于非水溶性以及高純性，更適合用于膠粘劑的合成與改性。本文即針對這類木質素，利用漆酶在不同pH值下對其進行活化處理，采用FT-IR、紫外分光光度計、GPC、TG等分析方法研究了酸堿度對漆酶活化處理木質素的影響。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

玉米秸稈木質素，松原來禾化學有限公司；漆酶，無錫金坤生物科技有限公司，酶活力為3 000 UI/g；冰醋酸、二氧六環、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、四氫呋喃等試劑均為分析純。

2.2 實驗方法與分析測試

2.2.1 漆酶活化處理木質素

將木質素置于50 ℃真空干燥箱內干燥24 h后備用。將粉體漆酶以蒸餾水為溶劑配成酶活力為20 UI/mL的酶溶液。稱取一定量的木質素，溶于二氧六環和水的混合溶劑中，加入一定量的漆酶后，用冰醋酸調節pH值，反應溫度設定為50 ℃。分別在不同pH值（5.5，5.0，4.5，4.0，3.5）下反應3 h，反應期間持續通氧。反應結束后，向反應液中加入蒸餾水析出木質素，抽濾，之后將濾餅置于沸水中使殘余漆酶失活，再次抽濾，干燥后備用。

2.2.2 分析測試

采用美國尼高力（Nicolet）公司的Magna-IR560型傅立葉變換紅外光譜儀對樣品進行衰減全反射紅外光譜分析，掃描范圍4 000～650 cm-1，分辨率4 cm-1，環境氣氛為空氣。根據文獻[18]的方法測定酚羥基含量：取每種樣品15 mg左右，溶于10 mL二氧六環，然后依次取2 mL溶液3份，分別用pH=6的KH2PO4和NaOH的緩沖溶液、pH=12的H3BO3和NaOH的緩沖溶液、濃度為0.2 mol/L的NaOH溶液定容為50 mL，采用北京普析通用儀器有限責任公司的T6新世紀紫外可見分光光度計，測定各樣品溶液在波長300 nm與360 nm處的吸光度。采用美國安捷倫公司的Agilent1100GPC液相色譜儀進行木質素分子質量測定[19]，檢測條件：G1315B紫外檢測器，標樣為聚苯乙烯（PS），流動相：四氫呋喃。色譜分析條件：79911GP-101+79911GP-104型號雙柱串聯；流速1.0 mL/min，進樣量50μL；柱溫30 ℃；柱壓2.9 MPa。采用德國NETZSCH公司的TG209F3熱重分析儀對樣品進行熱重分析，掃描溫度范圍30～800 ℃，升溫速率10 K/min，氣氛為空氣，氣體流速50 mL/min。

3 結果與討論

3.1 紅外分析

未處理以及不同pH值下漆酶處理木質素的紅外譜圖如圖1所示。從圖1可以看出，與未處理木質素相比，漆酶活化處理后的木質素沒有發生官能團的消失或增加，只是一些官能團的含量出現了變化。1 596 cm-1、1 510 cm-1和1 426 cm-1處均出現較強烈的苯環吸收峰，屬于木質素芳香環的骨架振動吸收。漆酶沒有破壞木質素的芳香環結構，處理過程中的反應主要發生在側鏈和苯環的活性官能團上，因而選取1 510 cm-1處苯環吸收峰作為內標峰，分別計算木質素其他特征吸收峰與內標峰的峰面積比值，結果列于表1。

圖1 未處理木質素以及不同pH下漆酶處理木質素的紅外譜圖Fig.1 FT-IR spectra of lignin untreated（0） and treated（1～5） with laccase at different pH value

從表1可以看出，經漆酶處理后，由O-H的伸縮振動吸收引起的3 300 cm-1吸收峰增加，表明羥基含量增大，且隨著pH值的降低，羥基含量增加，但效果不明顯；當pH達到3.5時，羥基含量增加程度減弱；2 920 cm-1處甲基、亞甲基、次甲基的 C-H吸收峰減弱，表明處理后，木質素發生一定降解，化學鍵斷裂，生成小分子木質素；2 854 cm-1處甲氧基特征峰吸收減弱，表明漆酶處理具有一定的脫甲氧基作用，木質素發生一定的解聚。對比可知，pH值在4.0左右時，漆酶對木質素的活化作用效果較好。1 120 cm-1、1 329 cm-1附近紫丁香基結構單元的特征峰和 1 256 cm-1處愈創木基的譜峰吸收減弱，進一步證明了漆酶對木質素有一定的降解作用。1 030 cm-1處醚鍵C-O略有上升，表明漆酶在對木質素活化的過程中，不僅存在解聚降解作用，同時還存在聚合作用，即漆酶會使木質素大分子產生一些小分子自由基，這些小分子可能相互結合，也可能與大分子木質素結合。

表1 木質素的吸收峰與內標峰1 510 cm-1的峰面積比值Tab.1 Area ratio of characteristic peaks and reference peak at 1510 cm-1for lignin

3.2 紫外分析

表2列出了不同pH值下漆酶活化處理后木質素的羥基含量。由表2可以看出，經漆酶活化處理后，木質素的總羥基含量增加，并且隨著pH值的降低，羥基含量先增加后降低。處理過程中木質素脫甲氧基產生部分酚羥基，醚鍵形式存在下的酚羥基由于醚鍵的斷裂出現新的酚羥基，但部分酚羥基可能再次與其他木質素分子以醚鍵結合，造成羥基含量下降，這進一步印證了紅外光譜的分析結果。

3.3 GPC分析

通過測定一組分子質量不等的聚苯乙烯標準樣品的淋出時間與分子質量的數據，進行作圖、擬合，得到擬合曲線與擬合方程，擬合方程為：Lg（M）=10.60098-0.50533t。由此計算木質素的分子質量，如圖2和表3所示。

表2 不同pH值下漆酶活化木質素的羥基含量Tab.2 Content of phenolic hydroxyl group of lignin treated with laccase at different pH values

圖2 未處理以及漆酶活化處理木質素的分子質量分布譜圖Fig.2 Molecular weight distributions of lignin untreated and treated with laccase

表3 未處理以及漆酶活化處理木質素的分子質量統計Tab.3 Statistics of molecular weight of lignin untreated and treated with laccase

表3可以看出，經漆酶處理后，木質素的分子質量既有降低又有升高。數均分子質量隨著pH值的降低先降低后增加；重均分子質量在pH=5.5時表現為降低，然后隨著pH的降低開始升高。圖2也表明，經過漆酶處理后，分子質量在A點處的數量出現了減少，3號譜線（pH=4.5）的峰高降低，分子質量在C點處的數量明顯減少，分子質量在B點處的數量略有增加。分析認為，漆酶對木質素既有解聚作用又有聚合作用，漆酶會使木質素分子內的一些聯接鍵斷裂，發生脫羧、脫甲基的作用，使木質素分子質量降低，并產生小分子片段。C處減少較明顯可能是由于漆酶優先作用于較小的木質素分子，使小分子木質素降解，其中一部分分散到D區域，另一部分會與大分子木質素聚合，導致在分子質量更高的B點出現峰。對比pH=4.5、4.0、3.5時的羥基含量和重均分子質量，可以認為，漆酶的氧化作用使木質素發生脫甲基作用，引起酚羥基含量增大；同時，漆酶可氧化酚羥基變成苯氧自由基[20,21]，進行非選擇性交聯使得分子質量增大，導致多分散性增大[22]。漆酶催化氧化過程是其內部活性中心銅離子和底物之間電子傳遞的復雜過程，這個過程中底物將轉化為酚氧自由基中間體，形成的自由基中間體很不穩定，能夠進一步發生解聚或聚合反應[23]。不同pH值的環境下，漆酶表現活性不同，產生的自由基數目也不一樣。pH較高（5.5）時，漆酶對木質素的降解作用占優，此環境下更多的自由基相互結合為小分子，只有少部分結合到大分子木質素上。而隨著pH值的降低，漆酶對木質素的聚合作用開始增加，當pH達到3.5時，主要表現為漆酶對木質素的聚合作用。漆酶與木質素的作用過程復雜，上述分析只是推測，實際的反應機理還需結合其他分析進一步驗證。值得注意的是，由于所用木質素種類、來源以及分析測試的影響，本文所得分子質量數據的數量級與其他文獻報道的不盡相同。

3.4 TG分析

未處理木質素以及不同pH值下漆酶活化處理的木質素的TG分析結果如圖3和表4所示。從表4可以看出，經過漆酶處理后，樣品的起始分解溫度降低，證實木質素發生部分降解，生成了小分子木質素，使木質素整體在低溫區域的熱穩定性下降。經過漆酶處理后，終止點溫度出現上升，證明漆酶對木質素也有聚合作用，有更大分子質量的木質素生成，這與GPC測試結果相符。拐點溫度上升，說明經過漆酶處理后，木質素的分子質量集中區域向高分子質量區域移動。隨著pH值的降低，漆酶的活性相應提高，漆酶使部分木質素降解，產生小分子片段與自由基，而自由基大部分會與大分子的木質素相結合，生成更大分子質量的木質素。

圖3 未處理木質素和漆酶處理木質素的TGA曲線和DTG曲線Fig.3 TGA and DTG curves of lignin untreated and treated with laccase

表4 未處理木質素和漆酶處理木質素的熱重曲線數據統計Tab.4 Statistics of thermogravimetric curves of ligninuntreated and treated with laccase

4 結論

漆酶作用于玉米秸稈木質素，可以使木質素發生脫甲基作用，酚羥基含量增加，進而提高木質素的反應活性。但較低的pH環境又會使漆酶催化氧化更多酚羥基，造成酚羥基的消耗，綜合考慮pH值為4.0左右活化處理效果較好。漆酶處理玉米秸稈木質素的過程中發生連接鍵斷裂，伴隨著解聚反應，生成小分子木質素；同時漆酶又會氧化酚羥基變成苯氧自由基，發生隨機聚合現象，生成更大分子質量的木質素。pH值較高的處理條件下表現為解聚作用，而pH值較低時則表現為聚合作用。

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Effect of pH value on properties of corn stalk lignin treated with laccase

ZHANG Nan, DI Ming-wei
(Key Laboratory of Bio-Based Material Science & Technology (Ministry of Education), Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040, China)

The activating treatment of corn stalk lignin with laccase was carried out at different pH value, and the effect of pH value on the properties of corn stalk lignin treated with laccase was studied by Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR), ultraviolet spectrophotometer, gel permeation chromatography(GPC) and thermal gravimetric analyzer(TGA). The results showed that the demethylation of corn stalk lignin occurred during the treating with laccase and the total phenolic hydroxyl group content of the treated lignin increased. The preferred pH value was chosen as 4.0. Both the depolymerization and the polymerization were presented during the treating of lignin with laccase. The depolymerization of lignin was main reaction for activating with laccase at higher pH value, and the polymerization of lignin was predominant at lower pH value.

corn stalk lignin; activation; laccase; pH value

O636.2

A

1001-5922（2015）06-0042-05

2015-03-10

張楠（1990-），男，在讀碩士研究生。

邸明偉（1972-），男，教授，博導，主要研究方向為生物質復合材料及膠粘劑。E-mail：dimingwei@126.com。

國家林業公益性行業科研專項（20150452）、黑龍江省科學基金資助項目（C201335）、黑龍江省哈爾濱市科技創新人才研究專項資金項目（2014RFXXJ066）。