羅仙子提取物對H2O2損傷平滑肌細胞的保護作用

胡文龍，褚夫江，鄭曉燕，鄭少婷，盧雪梅，金小寶，朱家勇(廣東藥學院基礎學院/藥用生物活性物質研究所/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006)

羅仙子提取物對H2O2損傷平滑肌細胞的保護作用

胡文龍，褚夫江，鄭曉燕，鄭少婷，盧雪梅，金小寶，朱家勇
(廣東藥學院基礎學院/藥用生物活性物質研究所/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006)

目的觀察羅仙子低分子量多肽提取物對SD大鼠大動脈平滑肌細胞氧化應激狀態下的保護作用。方法原代培養SD大鼠大動脈平滑肌細胞，傳代鑒定后分為對照組、模型組、羅仙子低分子量多肽提取物3個劑量組。H2O2誘導大動脈平滑肌細胞損傷模型，采用四甲基偶氮唑藍比色法檢測細胞存活數量，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，比色法測細胞培養液中谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、H2O2酶的活性及丙二醛含量。結果建立H2O2損傷模型的半數抑制濃度為480 μmol/mL。羅仙子低分子量多肽提取物各濃度干預組的細胞活力均明顯高于H2O2損傷模型組(P＜0.05)，并能顯著降低氧化應激損傷的大動脈平滑肌細胞所釋放的丙二醛，提高谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和H2O2酶的活性。結論羅仙子低分子量多肽提取物具有減輕H2O2損傷細胞的作用。

羅仙子低分子量多肽提取物；大動脈平滑肌細胞；氧化應激

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病發生的最直接原因之一[1]，其確切發病機制還未被完全闡明，氧化應激損傷是其中的一個重要機制。在血管的增齡性變化過程中，動脈中層的平滑肌細胞在氧化應激環境下的病理性增殖、凋亡和氧化應激信號分子的激活，是AS發生的重要環節，因此抗炎、抗氧化和抑制平滑肌細胞增殖是實現抗AS的重要途徑。羅仙子原名蛆，又稱五谷蟲、谷蟲，為我國傳統天然藥材之一。現已有不少研究證實羅仙子具有抗病毒[2]、抗腫瘤[3-5]、抗菌抗炎[6-7]、抗氧化[8-9]等功效。課題組前期研究發現羅仙子低分子量多肽提取物可降低AS小鼠與大鼠的血脂及炎癥因子水平，有效抑制AS的發生與發展[6，10]。在進一步的研究中，篩選獲得了羅仙子低分子量多肽提取物(相對分子質量＜30 000)，并對其在AS小鼠體內抗AS的作用進行了驗證，結果顯示該低分子量多肽提取物能有效改善動脈的粥樣化病變，有效降低動物血清中IL-1α及TNF-α的水平。同時，還發現經羅仙子低分子量多肽提取物處理后動物的動脈血管內膜完整性良好，血管內膜下浸潤的巨噬細胞數量減少[7]。基于此，本實驗以氧化應激損傷狀態下的SD大鼠血管平滑肌細胞作為模型，用羅仙子低分子量多肽提取物干預氧化應激損傷狀態下的大鼠血管平滑肌細胞，探討其對氧化應激損傷的大鼠平滑肌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

SD大鼠大動脈平滑肌細胞，原代培養，傳代后本實驗室保存；DMEM高糖培養基(Gibco公司)；胎牛血清、PI(MP公司)；Ⅱ型膠原蛋白酶(Worthington公司)；兔抗 α-SM抗體(Abcam公司)；MTT、Ⅳ型彈性蛋白酶(Sigma公司)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、H2O2酶(CAT)及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；羊抗兔二抗、DAPI(碧云天生物技術研究所)；AnnexinⅤ(Biolegend公司)；其他試劑為分析純。

1.2 SD大鼠大動脈平滑肌細胞的原代與傳代培養

參照文獻[11]，取4～6周齡雄性SD大鼠大動脈，剝凈血管外脂肪和結締組織，縱向切開血管，刮除內皮后剪碎，用膠原蛋白酶和彈性蛋白酶消化獲取大動脈平滑肌細胞。此后隔天更換培養液，直至形成單層細胞，用含0.25%胰酶消化，進行傳代培

養，鑒定后取5～10代細胞用于實驗。

1.3 免疫熒光和流式細胞術檢測平滑肌細胞α-SM表達情況

將潔凈的圓形小玻片置于細胞培養孔中，細胞濃度調至每片5×104個，次日取出板孔中細胞爬片，4%(φ)多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌2～3次；滴加封閉液覆蓋爬片，室溫靜置60 min；加入稀釋度為1∶200的兔抗α-SM抗體，37℃孵育90 min，PBS洗滌同上；滴加稀釋度為1∶200的羊抗兔IgG-FITC，洗滌完畢后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 MTT法測定細胞活性

取生長狀態良好細胞，調整細胞密度為8×104個/mL，按0.1 mL含細胞的培養液接種于96孔板培養24 h，隨機分為對照組、H2O2模型組、羅仙子低分子量多肽提取物組(0、5、20、80 μg/mL)。培養12 h后棄除培養基，各孔都加入篩選獲得H2O2(IC50)；12 h后更換為100 μL/孔MTT，4 h后再次更換為100 μL/孔DMSO，待紫色結晶充分溶解后用酶標儀測490 nm處的吸收值(A值)。實驗設3個平行孔同時設定陰性對照和空白對照組，結果重復3次。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

將細胞按2×105個/孔接種6孔板，24 h后分組和給藥情況參照“1.4”；實驗完畢后分別收集上清液和細胞，加入1 mL結合緩沖液重懸細胞，離心后沉淀重懸在 100 μL的結合緩沖液中，加入 2 μL AnnexinⅤ，避光反應15 min后加入2 μL PI，繼續反應5 min，流式細胞儀檢測其凋亡情況。

1.6 檢測指標

收集“1.5”實驗處理后細胞上清液，按GSH-Px、MAO、SOD、CAT及MDA試劑盒說明書要求測定各指標含量。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 SD大鼠大動脈平滑肌細胞原代與傳代培養情況

培養24 h后，細胞貼壁呈長梭形，胞核呈桿狀或橢圓狀，可見2個或2個以上的核仁；72 h后，細胞呈束狀排列；2周后，各細胞群融合，呈波峰和波谷樣形態；傳代后細胞形態穩定。見圖1。

圖1 RASMC原代與傳代培養Figure 1 Primary culture and subculture of rat aortic smooth muscle cells

2.2 免疫熒光法和流式細胞術檢測平滑肌細胞α-SM表達情況

熒光顯微鏡下可見，胞質部分均著色且分布均勻，證實該細胞為血管平滑肌細胞。見圖2。

圖2 免疫熒光觀察大鼠血管平滑肌細胞α-SM的表達情況Figure 2 Expression of α-SM in rat aortic smooth muscle cells (200×)

2.3 MTT法測定細胞活性

不同濃度的H2O2對細胞的效應存在較大差異:當H2O2的濃度低于240 μmol/mL時，H2O2模型組的A值高于對照組；當其濃度高于240 μmol/ mL時，細胞存活率開始下降，并呈現劑量依賴性；當

H2O2濃度為480 μmol/mL時其A值降低到陰性對照組的一半，本實驗以此濃度作為H2O2氧化應激劑量進行建模，剩余約50%細胞存活。與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖3A。不同濃度的羅仙子低分子量多肽提取物干預后均可抑制H2O2從而引起 A值降低，并呈劑量依賴性，與H2O2模型組相比，差異均有統計學意義(P＜0.01)，見圖3B。

圖3 MTT法測定細胞存活率Figure 3 Survival rate of rat aortic smooth muscle cells by MTT

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

模型組的細胞凋亡率(35.77%)顯著高于對照組(4.70%，P＜0.01)。不同濃度羅仙子低分子量多肽提取物(5、20、80 μg/mL)預處理后，細胞凋亡率顯著下降(22.84%、18.21%、8.85%，P＜0.01)，見圖4。

2.5 過氧化物酶含量

與對照組比較，模型組的MDA含量明顯升高(P＜0.01)，SOD、CAT和GSH-Px的活性明顯降低(P＜0.01)；羅仙子低分子量多肽提取物干預后能夠顯著提高SOD、CAT和GSH-Px活性(P＜0.05或P＜0.01)，降低MDA含量(P＜0.01)，見表1。

圖4 流式細胞術檢測細胞凋亡Figure 4 Apoptosis of rat aortic smooth muscle cells

表1 羅仙子低分子量多肽提取物對模型大鼠血管平滑肌細胞MDA、SOD、CAT和GSH-Px活性的影響Table 1 Expression of MDA，SOD，CAT and GSH-Px in rat aorta smooth muscle cells treated with LMPHE(±s，n＝3)

表1 羅仙子低分子量多肽提取物對模型大鼠血管平滑肌細胞MDA、SOD、CAT和GSH-Px活性的影響Table 1 Expression of MDA，SOD，CAT and GSH-Px in rat aorta smooth muscle cells treated with LMPHE(±s，n＝3)

與對照組比較:＃＃P＜0.01；與模型組比較:?P＜0.05，??P＜0.01。

組別 劑量/ (μg·mL－1) MDA/ (nmol·mg－1) ρ(SOD)/ (U·mL－1) ρ(CAT)/ (U·mL－1) ρ(GSH-Px)/ (U·mL－1)對照組 － 1.08±0.02 9.07±0.23 1.26±0.09 76.67±2.09模型組 － 2.33±0.05＃＃5.59±0.21＃＃0.73±0.01＃＃52.18±1.05＃＃羅仙子 低劑量 5 2.07±0.03??6.74±0.02?0.75±0.02 53.99±1.15中劑量 20 1.71±0.01??7.33±0.15??0.84±0.01??55.09±1.20高劑量 80 1.29±0.04??8.50±0.20??0.95±0.03??62.50±0.73??

3 討論

在血管細胞中最重要的活性氧(ROS)是由單價還原氧生成的超氧陰離子自由基(O2－)，O2

－對血管本身無毒性作用，但在SOD的作用下，可使O2－轉化為H2O2，H2O2能與還原性過渡金屬反應生成高活性的羥自由基(OH－)，其能被髓過氧化物酶(MPO)代謝生成次氯酸(HOCl)等更為不穩定的ROS，進一步放大血管及氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)等應激損傷效應，特別是在斑塊的形成、破裂與血栓形成中尤為重要[12]。在各種不同形式的ROS中，H2O2的性質較為穩定，可被應激狀態下細胞產生的CAT 或GSH-Px還原為H2O，從而達到阻斷ROS進一步氧化損傷的目的，因此SOD和CAT的活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，MDA和GSHPx含量的高低又常作為細胞受自由基攻擊的嚴重程度的間接指標；而H2O2的作用類似于ox-LDL，能夠很好模擬體機體氧化應激的演化進程[13-14]。基于此，本研究通過不同濃度H2O2損傷大鼠大動脈平滑肌細胞，結果顯示，不同濃度的H2O2對細胞的效應存在較大差異，當H2O2的濃度低于240 μmol/ mL時，H2O2組的A值高于對照組，提示可能是較低濃度H2O2促進細胞增殖；當H2O2濃度高于240 μmol/mL時，細胞存活率開始下降，并隨著H2O2濃度增加而降低，呈現劑量依賴性。這可能由于氧化應激強度超出細胞耐受范圍，開始出現細胞凋亡。經篩選后獲得建立氧化應激模型的最佳H2O2濃度為480 μmol/mL，在此濃度作用下可引起50%左右的細胞凋亡。

動脈粥樣硬化主要表現為血管病變。在正常生理情況下，血管平滑肌細胞處于動脈中層，處于靜止期，主要發揮收縮功能。在氧化應激等病理情況下，機體內ROS增加，誘導血管平滑肌細胞重新進入細胞周期，增殖并移行至內膜，吞噬ox-LDL后形成粥樣斑塊。隨著病程進一步發展，大量蓄積的ROS會引起細胞凋亡，導致斑塊破裂及血栓形成[12]，并且由其引起的細胞凋亡效應要遠大于其所引起的細胞增殖現象[15]，因而抵抗氧化應激引起的細胞凋亡和抑制平滑肌細胞增殖是實現抗AS的重要途徑。目前已有不少研究證實羅仙子存在抗氧化功效，劉彬等[8]基于化學反應法采用脫氧核糖-鐵體系和鄰苯三酚自氧化體系分別測定了不同濃度的羅仙子提取物對OH－和O2－的清除率，同時采用H2O2氧化體系測定了提取物的抗氧化值，結果顯示羅仙子提取物對OH－和O2－的IC50分別為1.93 mg/mL和3.26 mg/mL，濃度為0.5%的提取物的抗氧化值為9.01 mg/g，相當于同濃度維生素C抗氧化值的1.29倍。同時測定了該提取物主要成分為富含小分子生物活性肽、氨基酸及糖類且具有耐熱性質，提示這些物質的存在均有可能加快氧自由基的清除速度，起到抗氧化的作用。在體外實驗中，Zhu等[9]將中性蛋白酶水解獲得的羅仙子小分子多肽提取物干預處理HepG2細胞，發現該小分子多肽成分通過有效減少胞內ROS的含量和提高抗氧化酶活性進而發揮體外抵抗H2O2應激損傷的作用。本課題組前期研究發現，羅仙子粗提物干預高脂血癥小鼠后可明顯逆轉肝臟的脂肪性病變，同時提高肝臟勻漿液中SOD活力，降低MDA的水平，具有一定的抗氧化和降血脂功能[10]。進一步采用葡聚糖凝膠過濾色譜分離純化后獲得該粗提物中的小分子量多肽混合物，其相對分子質量＜30 000，并在AS小鼠體內證實該小分子量多肽提取物為降血脂和抗AS的主要成分[7]。本實驗借助H2O2誘導平滑肌細胞建立氧化應激模型為研究對象，干預不同濃度羅仙子低分子量多肽提取物。結果顯示，與H2O2模型組相比，干預組細胞的凋亡率均顯著減低。另外，H2O2模型組中MDA含量明顯高于對照組，SOD、CAT和GSH-Px的活性明顯降低；應用羅仙子低分子量多肽提取物干預后能夠提高SOD、CAT和GSH-Px活性，同時降低MDA含量，提示該低分子量多肽提取物可能通過提高平滑肌細胞的抗氧化酶活力或啟動抗氧化相關基因，及時有效地清除氧化應激時產生的過量ROS以及阻斷氧自由基傳遞鏈，從而減少細胞在過度氧化應激狀態下的損傷。該低分子量多肽提取物的成分以及在調節細胞發揮抗氧化功能的具體機制尚有待于進一步探討。

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(責任編輯:幸建華)

Effect of the lower molecular peptide of housefly(Musca domestica)extractions on the injury of aortic smooth muscle cells induced by H2O2in SD rats

HU Wenlong，CHU Fujiang，ZHENG Xiaoyan，ZHENG Shaoting，LU Xuemei，JIN Xiaobao，ZHU Jiayong (Institute of Pharmaceutical Bioactive Substances Research，Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioactive Pharmaceutical Substances，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of the lower molecular peptide of housefly(Musca domestica)extractions(LMPHE)on the oxidative stress injury of SD rat aortic smooth muscle cells (RASMC).MethodsRASMC were isolated，cultured and identified with rabbit anti-α-SM antibody.Then RASMC were divided into five groups including the control group，the model group and three LMPHE-treated groups with different concentrations.The oxidative injury model was established by hydrogen peroxide(H2O2)stimulation.The cell vitality was measured by MTT.The apoptosis of cells was determined by flow cytometry.SOD，CAT，MDA and GSH-Px activities were assayed by micro-plate spectrophotemeter.ResultsThe value of half inhibitory concentration(IC50)to establish oxidative injury model was 480 μmol/mL at 12 hours.The cell vitality was increased in different LMPHE groups compared with the model group(P＜0.05).The activity of MDA was decreased，but the activities of CAT，SOD and GSH-Px were significantly enhanced in all LMPHE groups in comparison with that of the model group.ConclusionLMPHE can protect RASMC from oxidative injury induced by H2O2.

the lower molecular peptide of housefly extractions；rat aortic smooth muscle cells；oxidative stress

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.017

1006-8783(2015)05-0633-05

2015-06-01

國家自然科學基金項目(81274061)；廣東省戰略性新興產業核心技術攻關項目(2012A080800016)

胡文龍(1989—)，男，2013級碩士研究生，Email:wenlong＿hu＠hotmail.com；通信作者:朱家勇，男，教授，博士研究生導師，主要從事藥用生物活性物質的篩選、結構功能與應用研究，Email:zhujy＠gdpu.edu.cn。

時間:2015-10-16 16:25

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151016.1625.006.html