磷鉀生物菌肥的菌種篩選及應用研究

王凡+李雪+孫芳艷+羅喆+汪建明+喬長晟

摘要：從保存的47株菌中，根據(jù)解磷和解鉀能力強、菌株間無拮抗性的原則，確定了3株菌作為菌肥生產(chǎn)菌，分別為巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）。以3株菌作為生物菌肥生產(chǎn)菌株，對其進行發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵液施于吊蘭土壤進行植株種植試驗，結果表明施肥的植株在根長、株高、葉長、鮮重等明顯優(yōu)于空白對照組。

關鍵詞：菌肥;解磷菌;篩選;16S rDNA

中圖分類號：Q939.96;Q8 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2763-04

Screening and Applying Strains as a Microbial Fertilizer of Phosphate and Potassium

WANG Fan1，LI Xue2，SUN Fang-yan3，LUO Zhe2，WANG Jian-ming1，QIAO Chang-sheng2，3

（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China; 2.Tianjin Peiyang Biotrans Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China;

3.Tianjin Key Laboratory of Industry Microbiology/Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract： Three strains of bacteria including Bacillus megatherium，Bacillus thuringiensis，Bacillus mucilaginosus were screened according to great capacity of solubilzing phosphorus（P） and potassium（K） from 47 strains stored in the lab. Planting effect was tested with pot culture contained the fertilizer consisting of these three strains when it was applied to chlorophytum. The results showed that the fertilizer could increase length of roots and leaves，height of plant and fresh weight.

Key words： microbial fertilizer; phosphate-solubilizing bacteria; screen; 16S rDNA

由于化學肥料或有機肥料的大量施用以及施肥結構的不合理，中國農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的污染和破壞以及土壤理化性能下降等問題越來越嚴重。在綠色農(nóng)業(yè)已成為世界農(nóng)業(yè)發(fā)展方向的今天，應大力提倡、發(fā)展和施用微生物肥料，堅持走可持續(xù)發(fā)展的道路。

磷是植物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)元素之一，它以多種方式參與植物體內(nèi)生理生化過程，對促進植物的生長發(fā)育和新陳代謝起著重要的作用[1]。中國土壤中有大量含磷礦物質(zhì)存在，而可溶性磷缺乏，植物很難直接吸收利用[2]。研究表明，土壤中存在使難溶性磷溶解的微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，具有這種解磷能力的微生物叫做解磷菌[3]。

硅酸鹽細菌是土壤中一類能夠分解硅酸鹽類礦物并釋放出磷、鉀等元素供植物利用的細菌，同時具有固氮功能[4]。在植物根際能形成優(yōu)勢種，可以抑制其他病原菌的生長，達到增產(chǎn)的效果，其發(fā)酵液中有激素物質(zhì)，代謝產(chǎn)物如多糖、有機酸、蛋白質(zhì)等有刺激和調(diào)控作物生長的作用[5]。

利用生物菌肥將土壤中無效磷鉀轉(zhuǎn)變?yōu)榭衫脩B(tài)的磷鉀以供作物吸收利用，這無疑是一條新的重要的農(nóng)業(yè)技術途徑。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株 ?所用的菌株的名稱和來源見表1。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?蒙金娜無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·4H2O 0.03 g/L，Ca3（PO3）2 5.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min;解鉀種子培養(yǎng)基：淀粉5.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，K2HPO4·3H2O 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCO3 0.1 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005 g/L，pH 7.5～8.5，121 ℃滅菌20 min;解鉀發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCO3 0.1 g/L，鉀長石粉5.0 g/L，pH 7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min;通用培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，K2HPO4·3H2O 6.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，尿素1.5 g/L，酵母粉5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min;膠質(zhì)芽孢桿菌培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g/L，K2HPO4·3H2O 5.0 g/L，酵母粉0.5 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.02 g/L，CaCO3 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min;營養(yǎng)培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。endprint

1.1.3 ?主要儀器設備 ?電泳儀、基因擴增儀、立式壓力蒸汽滅菌鍋、凝膠分析儀、超凈工作臺、數(shù)顯pH計、恒溫振蕩搖床、原子吸收分光光度計、紫外-可見分光光度計，具體情況見表2。

1.2 ?方法

1.2.1 ?解磷菌的初篩 ?將試驗菌點接在蒙金娜無機磷平板上，5～7 d后觀察，菌落周圍有透明圈生成的即為解磷菌。

1.2.2 ?解磷菌的復篩 ?將初篩得到的各解磷菌1環(huán)接入蒙金娜無機磷液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵液以15 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用鉬銻抗比色法[6]測定發(fā)酵液中速效磷含量，將各菌含磷量扣除空白值后進行排序，選出5個高效解磷菌。

1.2.3 ?解鉀菌解鉀能力的測定 ?按照NY 882-2004附錄B的方法測定。

1.2.4 ?生物拮抗性 ?采用牛津杯法[7]將功能性強的菌株與膠質(zhì)芽孢桿菌進行拮抗性篩選，培養(yǎng)后觀察菌落周圍有無抑菌圈，選出互不拮抗的功能菌株。

1.2.5 ?未知菌株的菌種鑒定 ?①菌種初步鑒定。根據(jù)菌落形態(tài)與菌株生理生化特征，參照文獻[8]對分離所得菌株進行鑒定：革蘭氏染色、菌體形態(tài)鏡檢、淀粉水解、蔗糖發(fā)酵、葡萄糖產(chǎn)酸反應、V-P反應、MR反應。②16S rDNA的測序。C3解磷菌株的基因組提取參照參考文獻[9]，并以1%瓊脂糖凝膠電泳（110 V，35 min）驗證：基因組2.0 μL，marker 3.0 μL，經(jīng)EB染色10 min后，利用凝膠成像系統(tǒng)成像。采用購于北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司的PCR試劑盒進行PCR擴增（引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，GGTTACCTTGTTACGACTT）：94 ℃預變性2 min，擴增30輪（94 ℃變性45 s，56 ℃復性45 s，72 ℃延伸60 s），72 ℃延伸加時5 min，4 ℃保存。完成后每管加上樣緩沖液2.0 μL，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳（120 V，35 min）檢測，經(jīng)EB染色10 min后，利用凝膠成像系統(tǒng)成像，采用購于北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司的DNA凝膠回收試劑盒進行切膠回收純化，送至華大基因雙向測序鑒定，將測序結果雙向拼接后與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定菌種。

1.2.6 ?生物菌肥產(chǎn)品的制備 ?①生長曲線的測定。將解磷菌接于裝有100 mL通用培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng);定期取樣，測定其OD600 nm;將膠質(zhì)芽孢桿菌接于裝有50 mL膠質(zhì)芽孢桿菌培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)，定期取樣，測定其OD400 nm，并確定產(chǎn)品菌體培養(yǎng)時間。②產(chǎn)品生物量測定。將達發(fā)酵終點的解磷菌與膠質(zhì)芽孢桿菌稀釋涂布于營養(yǎng)培養(yǎng)基與膠質(zhì)芽孢桿菌培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 h，計數(shù)。③菌體培養(yǎng)與收集。將各菌按上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至平穩(wěn)期，將各菌發(fā)酵液等體積混合，3 000 r/min，離心8 min，收集沉淀，以與總發(fā)酵液體積相等的自來水復溶菌體，即為成品肥液。

1.2.7 ?植株培養(yǎng)試驗 ?取300 g土壤，裝于花盆（盆底打孔）中，施加肥液200 mL，待肥液浸透土壤后，將長勢相當?shù)牡跆m植株幼體（無根，4片葉，葉長6 cm，平均株高6 cm，鮮重1 g）插于土中培養(yǎng)，每日澆水，每7 d追肥一次，同時設置空白對照組，當試驗組施肥時對照組施加等量自來水。定期觀察兩組植株長勢，測定土壤pH，45 d時觀察植株，測量株高、葉長、根長、鮮重等參數(shù)，與空白對照對比。

2 ?結果與分析

2.1 ?解磷菌的初篩

按“1.2.1”操作，平板上出現(xiàn)透明圈的菌株為C1、C2、C3、11433、r3、r4、r8、r10、11002、11003、11008、11010、11020。

2.2 ?解磷菌的復篩

采用鉬銻抗比色法對r3、r4、r8、r10、11002、11003、11008、11010、11020、11433、C1、C2、C3進行解磷量測定，結果見表3。確定11433、C1、C2、C3、11020為解磷菌，待做拮抗試驗。

2.3 ?解鉀菌解鉀能力的測定

按照“1.2.3”所述方法對解鉀菌進行解鉀量的測定，結果見表4。膠質(zhì)芽孢桿菌解鉀率為15.43%，有解鉀作用，待與解磷菌進行拮抗試驗。

2.4 ?生物拮抗性實驗

由表5可知，C1、C2與11433、C3、23575相互拮抗，根據(jù)產(chǎn)品功能定位，最終確定11433、C3、23575為目標菌株。

2.5 ?未知菌株16S rDNA鑒定

2.5.1 ?菌種初步鑒定 ?對篩選得到的解磷菌株C3進行初步鑒定，試驗結果見表6。根據(jù)試驗結果，將C3菌株初步歸為蘇云金芽孢桿菌類群。

2.5.2 ?16S rDNA測序 ?提取菌株基因組后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在約1 500 bp處出現(xiàn)明顯特征條帶，將DNA進行PCR擴增、純化、測序，測序后拼接結果經(jīng)在NCBI上比對分析，此菌與Bacillus thuringiensis Bt407同源性最高，二者在發(fā)育樹上處于同一個分支上。根據(jù)文獻[10]，確定C3為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

根據(jù)微生物肥料生物安全通用技術準則（NY 1109-2006）規(guī)定，蘇云金芽孢桿菌（C3）、巨大芽孢桿菌（11433）、膠質(zhì)芽孢桿菌（23575）的安全分級均為第一級，為可免做毒理學試驗的菌種，直接用于生產(chǎn)。endprint

故將菌肥生產(chǎn)菌株確定為蘇云金芽孢桿菌（C3）、膠質(zhì)芽孢桿菌（23575）、巨大芽孢桿菌（11433）。

2.6 ?生物菌肥產(chǎn)品的制備

2.6.1 ?生長曲線的測定 ?按照“1.2.6”所述方法，對3菌進行生長曲線的測定與繪制，如圖1所示。由圖1可知，11433與23575在15 h左右進入平穩(wěn)期，C3在18～19 h進入平穩(wěn)期，為獲得最大的菌體量，選擇11433與23575培養(yǎng)16 h，C3培養(yǎng)18 h。

2.6.2 ?發(fā)酵終點生物量的測定 ?根據(jù)“1.2.6”所述方法，對3菌發(fā)酵液進行涂布計數(shù)，測得此時發(fā)酵液的菌體濃度均達到108個/mL以上。

2.7 ?植株培養(yǎng)試驗

采用成品肥液種植吊蘭，45 d時觀察吊蘭長勢（圖2，表7），可見，施肥植株的長勢明顯優(yōu)于空白對照，體現(xiàn)在葉長、根長、葉片展闊程度上。施肥植株的根系發(fā)達，葉長有明顯增長，新生葉片也多于空白對照，磷鉀生物菌肥對植株的生長起到了促進作用。

施肥后的土壤pH比未施肥的土壤pH有明顯降低（表8），這可能是由于菌體在生長過程中分泌了酸類物質(zhì)至土壤中。

3 ?小結與討論

本研究從47株菌種篩選出2株解磷菌巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，同時鑒定了膠質(zhì)芽孢桿菌的解鉀能力。對C3的個體形態(tài)進行觀察與鑒定，結合菌落形態(tài)、生理生化指標和16S rDNA序列分析，確定C3為蘇云金芽孢桿菌。將此3菌進行培養(yǎng)并測定生長曲線，確定平穩(wěn)期到達時間并以此作為培養(yǎng)終點，以獲得較大生物量。培養(yǎng)后取菌體與發(fā)酵液等體積自來水混合，施于土壤，培養(yǎng)吊蘭幼體，45 d時觀察吊蘭長勢，其根長、葉長、葉片展闊程度與葉表光澤均表明施肥液培養(yǎng)的吊蘭狀態(tài)優(yōu)于空白對照，且施加了菌肥的土壤其pH有明顯的下降，說明菌體對植株的生長有促進作用，這是由于菌體在生長過程中將土壤中難溶性的磷鉀分解為可被植物利用的形態(tài)，促進植株生長。并且施加了菌肥的土壤pH降低，這能否改變中國北方的鹽堿性土壤有待進一步研究。

參考文獻：

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[9] 薩姆布魯克 J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南[M].北京：科學出版社，2003.

[10] HOLT J G，KRIEGNR.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology[M]. 9th ed.Baltimore London：Williams & Wilkins Co，1994.endprint

故將菌肥生產(chǎn)菌株確定為蘇云金芽孢桿菌（C3）、膠質(zhì)芽孢桿菌（23575）、巨大芽孢桿菌（11433）。

2.6 ?生物菌肥產(chǎn)品的制備

2.6.1 ?生長曲線的測定 ?按照“1.2.6”所述方法，對3菌進行生長曲線的測定與繪制，如圖1所示。由圖1可知，11433與23575在15 h左右進入平穩(wěn)期，C3在18～19 h進入平穩(wěn)期，為獲得最大的菌體量，選擇11433與23575培養(yǎng)16 h，C3培養(yǎng)18 h。

2.6.2 ?發(fā)酵終點生物量的測定 ?根據(jù)“1.2.6”所述方法，對3菌發(fā)酵液進行涂布計數(shù)，測得此時發(fā)酵液的菌體濃度均達到108個/mL以上。

2.7 ?植株培養(yǎng)試驗

采用成品肥液種植吊蘭，45 d時觀察吊蘭長勢（圖2，表7），可見，施肥植株的長勢明顯優(yōu)于空白對照，體現(xiàn)在葉長、根長、葉片展闊程度上。施肥植株的根系發(fā)達，葉長有明顯增長，新生葉片也多于空白對照，磷鉀生物菌肥對植株的生長起到了促進作用。

施肥后的土壤pH比未施肥的土壤pH有明顯降低（表8），這可能是由于菌體在生長過程中分泌了酸類物質(zhì)至土壤中。

3 ?小結與討論

本研究從47株菌種篩選出2株解磷菌巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，同時鑒定了膠質(zhì)芽孢桿菌的解鉀能力。對C3的個體形態(tài)進行觀察與鑒定，結合菌落形態(tài)、生理生化指標和16S rDNA序列分析，確定C3為蘇云金芽孢桿菌。將此3菌進行培養(yǎng)并測定生長曲線，確定平穩(wěn)期到達時間并以此作為培養(yǎng)終點，以獲得較大生物量。培養(yǎng)后取菌體與發(fā)酵液等體積自來水混合，施于土壤，培養(yǎng)吊蘭幼體，45 d時觀察吊蘭長勢，其根長、葉長、葉片展闊程度與葉表光澤均表明施肥液培養(yǎng)的吊蘭狀態(tài)優(yōu)于空白對照，且施加了菌肥的土壤其pH有明顯的下降，說明菌體對植株的生長有促進作用，這是由于菌體在生長過程中將土壤中難溶性的磷鉀分解為可被植物利用的形態(tài)，促進植株生長。并且施加了菌肥的土壤pH降低，這能否改變中國北方的鹽堿性土壤有待進一步研究。

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[10] HOLT J G，KRIEGNR.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology[M]. 9th ed.Baltimore London：Williams & Wilkins Co，1994.endprint

故將菌肥生產(chǎn)菌株確定為蘇云金芽孢桿菌（C3）、膠質(zhì)芽孢桿菌（23575）、巨大芽孢桿菌（11433）。

2.6 ?生物菌肥產(chǎn)品的制備

2.6.1 ?生長曲線的測定 ?按照“1.2.6”所述方法，對3菌進行生長曲線的測定與繪制，如圖1所示。由圖1可知，11433與23575在15 h左右進入平穩(wěn)期，C3在18～19 h進入平穩(wěn)期，為獲得最大的菌體量，選擇11433與23575培養(yǎng)16 h，C3培養(yǎng)18 h。

2.6.2 ?發(fā)酵終點生物量的測定 ?根據(jù)“1.2.6”所述方法，對3菌發(fā)酵液進行涂布計數(shù)，測得此時發(fā)酵液的菌體濃度均達到108個/mL以上。

2.7 ?植株培養(yǎng)試驗

采用成品肥液種植吊蘭，45 d時觀察吊蘭長勢（圖2，表7），可見，施肥植株的長勢明顯優(yōu)于空白對照，體現(xiàn)在葉長、根長、葉片展闊程度上。施肥植株的根系發(fā)達，葉長有明顯增長，新生葉片也多于空白對照，磷鉀生物菌肥對植株的生長起到了促進作用。

施肥后的土壤pH比未施肥的土壤pH有明顯降低（表8），這可能是由于菌體在生長過程中分泌了酸類物質(zhì)至土壤中。

3 ?小結與討論

本研究從47株菌種篩選出2株解磷菌巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，同時鑒定了膠質(zhì)芽孢桿菌的解鉀能力。對C3的個體形態(tài)進行觀察與鑒定，結合菌落形態(tài)、生理生化指標和16S rDNA序列分析，確定C3為蘇云金芽孢桿菌。將此3菌進行培養(yǎng)并測定生長曲線，確定平穩(wěn)期到達時間并以此作為培養(yǎng)終點，以獲得較大生物量。培養(yǎng)后取菌體與發(fā)酵液等體積自來水混合，施于土壤，培養(yǎng)吊蘭幼體，45 d時觀察吊蘭長勢，其根長、葉長、葉片展闊程度與葉表光澤均表明施肥液培養(yǎng)的吊蘭狀態(tài)優(yōu)于空白對照，且施加了菌肥的土壤其pH有明顯的下降，說明菌體對植株的生長有促進作用，這是由于菌體在生長過程中將土壤中難溶性的磷鉀分解為可被植物利用的形態(tài)，促進植株生長。并且施加了菌肥的土壤pH降低，這能否改變中國北方的鹽堿性土壤有待進一步研究。

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[10] HOLT J G，KRIEGNR.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology[M]. 9th ed.Baltimore London：Williams & Wilkins Co，1994.endprint