湖北省灰葡萄孢抗藥性測定及抗藥分子機制研究

李若晨+張靜+李國慶

摘要：評價湖北省灰葡萄孢（Botrytis cinerea）群體抗藥性水平，為防治灰霉病提供理論依據，評估了源于湖北省的96個灰葡萄孢菌株對4種殺菌劑的抗性。結果表明，大部分菌株對多菌靈、農利靈和菌核凈敏感，抗性菌株出現的頻率分別為5%、2%和3%;所有供試菌株均對環酰菌胺敏感，EC50為0.004～0.200 μg/mL;對Bc-hch基因序列擴增和酶解譜帶分析結果進一步證實了供試菌株對環酰菌胺敏感。抗性菌株抗藥相關基因β-微管蛋白和組氨酸激酶基因的氨基酸序列比對結果顯示，部分位點的突變是抗藥性形成的可能機制之一，另外也發現了新的突變位點。

關鍵詞：灰葡萄孢（Botrytis cinerea）;多菌靈;農利靈;菌核凈;環酰菌胺;抗藥性;湖北省

中圖分類號：S481.4 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2800-06

Monitoring Fungicide Resistance of Botrytis cinerea from Hubei Province and Molecular Mechanisms of Resistance

LI Ruo-chen，ZHANG Jing，LI Guo-qing

（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Plant Pathology of Hubei Province，Wuhan 430070，China）

Abstract： Resistance of 96 B.cinerea strains from Hubei Province to four fungicides were studied. Most strains were sensitive to carbendazim，vinclozolin and dimethachlon with the frequency of resistant strains of 5%，2% and 3%， respectively. All B.cinerea strains investigated were susceptible to fenhexamid with the EC50 values ranging from 0.004 μg/mL to 0.2 μg/mL.The sensitivity to fenhexamid was proved from the results of analyzing the genotype at the Bc-hch locus. Partial amino acid sequences of β-tubulin and histidine kinase gene showed that point mutation was found to be associated with resistance to these fungicides. The fungicide resistance in populations of B.cinerea in Hubei Province was reported firstly.

Key words： Botrytis cinerea; carbendazim; vinclozolin; dimethachlon; fenhexamid; fungicide resistance

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一類世界分布的重要植物病原菌，可以危害大田作物、觀賞植物、蔬菜和水果等400多種寄主植物[1]，引發灰霉病，也常稱為灰霉菌。化學防治是目前防治灰霉病發生的主要方法，國內使用的殺菌劑主要有苯并咪唑類、二甲酰亞胺類等;但灰葡萄孢變異大，極易對殺菌劑產生抗藥性[2，3]。1971年荷蘭在溫室中的仙客來上發現了抗多菌靈的灰霉菌菌株[4]，國內于1987年由周明國等[5]首次報道了抗多菌靈的灰霉菌菌株。二甲酰亞胺類抗性菌株出現于20世紀80年代，在瑞典、加拿大等地都有報道[6，7]。

長期以來，農業生產上防治灰霉病主要依靠化學殺菌劑，連續及大量使用已使抗性菌株頻率增高，防效下降，在某些地區甚至喪失防效[8]，美國等多個國家已經禁止多菌靈的生產及應用。國內外研究者對包括B.cinerea在內的重要植物病原真菌對不同類型殺菌劑的抗藥水平及機制進行了研究[9-11]，以提高藥劑的防治效果，延長藥劑的使用年限。Kim等[12]檢測韓國部分地區人參上的灰葡萄孢對多菌靈、多菌靈乙霉威混合藥劑的敏感性，發現單抗多菌靈的菌株β-微管蛋白的198位氨基酸由谷氨酸突變成丙氨酸，與前人研究結果一致;同時抗兩種處理藥劑的菌株的198位谷氨酸突變為纈氨酸。馮丹等[13]對浙江省衢州地區柑橘綠霉病菌對多菌靈的抗性水平進行了檢測，發現抗性菌株β-微管蛋白基因核苷酸992位發生點突變，引起對應200位氨基酸由苯丙氨酸變為酪氨酸。Fournier等[14]報道灰葡萄孢對環酰菌胺的抗性與Bc-hch基因的多態性有關。

目前鮮見湖北省灰葡萄孢對多種殺菌劑抗藥性的檢測研究報道，本研究明確湖北省內灰葡萄孢對不同類型殺菌劑的抗性趨勢，了解抗藥分子機制，對指導農業生產、減緩抗性菌株產生具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?供試菌株 ?共96株灰葡萄孢菌株，其中36株是湖北省不同地區不同寄主的灰葡萄孢單孢分離物，另外對武漢一油菜田塊進行連續2年的采樣收集60株菌株。菌株具體情況見表1。endprint

1.1.2 ?供試藥劑 ?選用4種殺菌劑，分別為多菌靈（25% WP，上海升聯化工有限公司）、農利靈（50% WG，德國巴斯夫股份有限公司）、菌核凈（70% WP，美國巨邦農資國際貿易公司）和環酰菌胺（99.5%原藥，Dr.Ehrenstorfer GmbH）。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?菌株對殺菌劑抗藥性分析 ?采用測量菌落直徑的方法進行抗藥性測定。設定6個濃度梯度，每個濃度5個重復，用無菌水將多菌靈、農利靈和菌核凈分別稀釋成0.50、0.50、8.00 mg/mL（有效成分量，下同）的母液，用無水乙醇將環酰菌胺稀釋成0.05 mg/mL母液，將各藥劑母液按一定的比例加入到培養基中（藥劑在培養基滅菌后，溫度降到40 ℃左右時加入），制成不同濃度的含藥培養基平板，含藥培養基平板的最終含藥量見表2，以不加藥劑的培養基為對照。將待測的菌株在PDA培養基上20 ℃培養2 d，用直徑6 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌餅移植到含藥PDA平板上，20 ℃的恒溫箱中黑暗培養48 h，十字交叉法測量菌落直徑，根據菌落直徑的平均值計算藥劑對菌絲生長的抑制率。

抑制率=（對照菌落直徑–藥劑處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

根據抑制率查表得到對應的幾率值，將藥劑濃度轉化為對數值。以幾率值為縱坐標，濃度對數值為橫坐標，得到毒力回歸方程，根據毒力回歸方程求得殺菌劑的EC50（有效中濃度）。對抗性菌株，提高殺菌劑用量，以確定EC50。通過比較EC50確定抗性水平。菌株對不同殺菌劑的抗藥性水平鑒定標準見表3。

1.2.2 ?β-微管蛋白和組氨酸激酶基因克隆及序列分析 ?克隆β-微管蛋白基因PCR引物參考Ziogas等[15]的方法，引物 BctubF/BctubR，在NCBI上下載組氨酸激酶基因序列5 752 bp（Accession No.AF396827），使用引物設計軟件Primer 5.0 設計引物 Bos2-F/Bos2-R對組氨酸激酶的部分區域進行擴增。引物序列見表4。

進行PCR擴增。β-微管蛋白基因和組氨酸激酶基因的PCR反應程序為：94 ℃變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環;72 ℃延伸10 min。對于PCR產物使用回收試劑盒AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit （Axygen Scientific，Inc. Union City，USA）進行回收純化，將PCR產物連接到pMD18-T載體（TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China）上，轉入大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）細胞。挑選抗性平板上陽性克隆并檢測插入片段的大小。每個菌株的β-微管蛋白基因和組氨酸激酶基因分別挑選3個陽性克隆送奧科公司（Bei-jing AuGCT Biotechnol.Co.，Ltd.，Beijing，China）測序。對代表菌株的序列使用DNAMAN 軟件（version 5.2.2， Lynnon Corporation，Vaudreuil，Quebec，Canada）進行拼接處理。

1.2.3 ?Bc-hch序列擴增和酶解 ?擴增Bc-hch基因1 171 bp，引物序列見表4。Bc-hch基因的PCR反應程序為：94 ℃變性5 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環;72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將膠置于EB染色液中染色10 min，在紫外光下觀察擴增結果。40 μL PCR產物加入0.5 μL限制性內切酶HhaⅠ（Promega，USA），37 °C酶切過夜。終止反應，取10 μL酶切產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，將膠置于EB染色液中染色10 min，在紫外光下觀察酶切結果。

2 ?結果與分析

2.1 ?不同菌株抗藥性水平

96個菌株對4種殺菌劑的EC50測定結果（表5）表明，大部分菌株為多菌靈、農利靈和菌核凈敏感菌株，抗性菌株出現的頻率分別為5%、2%和3%。其中菌株08NE35、09NE37、GBC-2和GjBC-1抗其中2種或2種以上殺菌劑。在多菌靈抗性試驗中，敏感性菌株的EC50為0.035～0.133 μg/mL，高抗性菌株的EC50為792.7～1 456.9 μg/mL，高抗性菌株09NE37、08NE35、GBC-2、RosaBC-3和GjBC-1的抗性是敏感性菌株的5 960～36 423倍。在農利靈抗性試驗中，敏感性菌株的EC50為0.104～0.244 μg/mL，中抗性菌株GBC-2的EC50為0.747 μg/mL，抗性是最敏感性菌株的7倍左右。高抗性菌株GjBC-1的EC50為4.520 μg/mL，抗性是敏感性菌株的19～43倍。在菌核凈抗性試驗中，敏感性菌株的EC50為0.188～1.601 μg/mL，中抗性菌株GBC-2的EC50為2.988 μg/mL，其抗性是敏感性菌株的2～16倍，高抗性菌株08NE35和09NE37的EC50為15.50 μg/mL和17.60 μg/mL，抗性是敏感菌株的10～82倍和11～94倍。在環酰菌胺抗性試驗中，96株供試菌株均對環酰菌胺敏感，EC50為0.004～0.204 μg/mL。

2.2 ?菌株的抗性機制

對抗多菌靈的灰霉菌株（08NE35、09NE37、GBC-2、GjBC-1和RosaBC-3）的β-微管蛋白基因檢測，得到部分β-微管蛋白基因741 bp，其翻譯產物共246個氨基酸，有2個突變位點：菌株08NE35、09NE37、GBC-2、GjBC-1和RosaBC-3在128位的E（谷氨酸）突變為A（丙氨酸），菌株GBC-2在63位的F（苯丙氨酸）突變為L（亮氨酸）（圖1）。endprint

對抗二甲酰亞胺類殺菌劑（農利靈或菌核凈）的灰葡萄孢菌株（GjBC-1、GBC-2、08NE35和09NE37）的組氨酸激酶基因檢測，得到部分組氨酸激酶基因849 bp，翻譯產物共282個氨基酸，有4個位點突變。菌株GjBC-1有2個位點突變，在82位和86位并分別由原來的Q（谷氨酰胺）和N（天冬酰胺）變異為P（脯氨酸）和S（絲氨酸）。菌株GBC-2有一個位點突變在78位并由原來的I（異亮氨酸）變異為N（天冬酰胺）。菌株09NE37有一個位點突變在274位，由原來的E（谷氨酸）突變為G（甘氨酸），菌株08NE35在所擴增的區域沒有發現突變位點（圖2）。

在酰胺類殺菌劑（環酰菌胺）的試驗中，96株灰葡萄孢菌株的Bc-hch 基因進行擴增并得到1 171 bp的片段。使用限制性內切酶 Hha I 酶切Bc-hch 基因片段，酶切后的片段大小為517 bp和367 bp，說明這些菌株均對環酰菌胺敏感，與毒力測定結果（表5）一致。

3 ?小結與討論

本研究對湖北省內灰葡萄孢群體抗藥性水平進行了評價，篩選到苯并咪唑類和二甲酰亞胺類殺菌劑的抗性菌株，但是并未發現酰胺類殺菌劑的抗性菌株，且連續2年在同一油菜田地中檢測到了同時抗苯并咪唑類和二甲酰亞胺類殺菌劑的菌株08NE35、09NE37。

已有研究認為β-微管蛋白氨基酸的改變與抗苯并咪唑類藥物有關[12，16，17]。在抗性菌株中，β-微管蛋白的198位和200位氨基酸發生了改變。本研究也發現在擴增片段的128位（β-微管蛋白的198位）由谷氨酸突變成丙氨酸，但仍有個別菌株在其他位點還有突變，這個位點與抗藥性的關系還有待進一步確認。Oshima等[18]報道，組氨酸激酶氨基酸的改變與抗二甲酰亞胺類殺菌劑有關，分為4種類型：①基因的第365位的密碼子由異亮氨酸突變成天冬酰胺、精氨酸或者絲氨酸;②基因的第385位密碼子由異亮氨酸變為絲氨酸;③3個突變點（368位密碼子由纈氨酸變為苯丙氨酸、369位密碼子由谷氨酰胺變為組氨酸、447位密碼子由蘇氨酸變為絲氨酸）;④2個突變點（369位密碼子由谷氨酰胺變為脯氨酸、373位密碼子由天冬酰胺變為絲氨酸）。本研究的GBC-2為類型①由異亮氨酸突變成天冬酰胺，GjBC-1為類型④。

本研究中得到抗二甲酰亞胺類菌株08NE35、09NE37、GBC-2、GjBC-1，其中08NE35、09NE37抗菌核凈，GBC-2、GjBC-1抗農利靈，所得到的分子生物學研究結果也顯示4株菌株存在不同的抗性突變位點或沒有在擴增區域發現突變位點，且09NE37的突變和前人報道[18]的不一致，其突變位點可能是菌株抗菌核凈的分子機制之一，08NE35在所擴增的區域中沒有發現突變位點，有可能是突變位點并沒有包含在所擴增的片段之內，另外還可能是其他的抗性機制。本研究的菌株對環酰菌胺均為敏感菌株，并未發現抗性菌株，環酰菌胺是一類新型的殺菌劑，對湖北省來說，可能灰葡萄孢菌株還沒有產生對該藥劑的抗藥性。

本研究結果表明，灰葡萄孢對不同種類的殺菌劑敏感程度存在差異，EC50相差可達上萬倍;湖北省灰葡萄孢對不同種類的殺菌劑抗性趨勢存在多樣性。本研究在一定程度上為防治灰霉病的藥劑選擇提供了理論依據。

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