六種冬青屬苦丁茶葉片中綠原酸含量的RP—HPLC分析

田建平+李娟玲+胡遠艷+劉國民

摘要：采用超聲提取和RP-HPLC法分析了6種冬青屬苦丁茶新干燥的功能葉及苦丁茶冬青植物在不同發育階段、不同地域、野生與栽培材料、不同存放時間下功能葉中的綠原酸含量。結果表明，不同樣品材料中的綠原酸含量由大到小排序依次為苦丁茶冬青、霍山冬青、大葉冬青、五棱苦丁茶、華中枸骨、枸骨;新干燥的成熟葉樣品在室溫下存放2個月后綠原酸的含量顯著下降;在野生的苦丁茶冬青葉片不同發育階段中，一般是以老葉樣品中的綠原酸含量高;野生苦丁茶冬青植株葉片中綠原酸的含量要高于栽培植株葉片中綠原酸的含量。6種冬青屬苦丁茶葉片樣品中的綠原酸含量存在較大的種間差異。

關鍵詞：冬青屬苦丁茶;綠原酸;反相高效液相色譜;資源利用

中圖分類號：TS275.2 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2889-03

Comparison of Chlorogenic Acid in Leaves from Six Ilex Species Used as Kudingcha by RP-HPLC

TIAN Jian-ping1a，1b，2，LI Juan-ling1c，HU Yuan-yan1d，LIU Guo-min1a，1b

（1.a.Kudingcha Research Institute，b.College of Agriculture，c.Horticulture and Landscape College，d.Key Laboratory for Tropical Biological Resources，Hainan University，Haikou 570228，China;2.Department of Pharmacy，Hainan Medical College，Haikou 571101，China）

Abstract：Chlorogenic acid in the mature leaf was extracted ultrasonically and analyzed by RP-HPLC from six Ilex species and I.kudingcha in different developing stage，region and storaging time，wild and cultivated samples. The results showed that the content of chlorogenic acid in fresh mature leaves of six species was I. kudingcha> I. huoshanesis> I. latifolia > I. centrochinensis > I. pentagona > I. cornuta. The significant decrease of chlorogenic acid in dried fresh leaf was observed after two months. In general，its content in old leaf was highest among different developing stage，and the content of wild leaf was higher than cultivation one. There were large differences among six Ilex species in the contents of chlorogenic acid.

Key words： Kudingcha species in Ilex L.; chlorogenic acid; RP-HPLC; resource utilization

苦丁茶是我國民間廣泛用于制備代茶飲品（或茶藥兩用）的一大類代茶植物的統稱。其原植物來源廣泛，涉及12科13屬，至少有36種之多（含變種和變型）[1-3]。冬青屬苦丁茶是我國兩大類最重要的苦丁茶之一。該類苦丁茶主要包括苦丁茶冬青（Ilex kudingcha C.J.Tseng），大葉冬青（I. latifolia Thunb），枸骨（I. cornuta Lindl），霍山冬青（I. huoshanesis Y.H.He，五棱苦丁茶（I. pentagona S.K.chen Y.X.Feng et C.F.Liang），華中枸骨（I. centrochinensis S.Y.Hu）等6個物種。這些苦丁茶物種主要分布于我國廣東、廣西、海南、浙江、安徽和貴州等省區[4-6]。根據種植面積、經濟價值以及在國內外的影響情況，苦丁茶冬青被眾多專家認定為“大葉苦丁茶”正品。冬青屬苦丁茶中化學成分種類繁多，其中的綠原酸作為一種多酚活性成分，已廣泛應用于食品、醫藥和日用化工等領域。目前，有關冬青屬植物的綠原酸含量分析報道較少[7-9]。本試驗采用HPLC法比較了不同品種、不同產地、不同來源、不同發育時期和貯藏條件下苦丁茶葉片樣品中的綠原酸含量，為冬青屬苦丁茶植物種質資源的合理開發利用及產品質量控制提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試劑

冬青屬苦丁茶葉片樣品收集于全國各地，樣品經海南大學黃世滿教授鑒定，分別為冬青科植物苦丁茶冬青、大葉冬青、五棱苦丁茶、枸骨、霍山冬青和華中枸骨，其中苦丁茶冬青包含野生與栽培2類樣品，其余5種均為栽培樣品。憑證標本保存于海南大學苦丁茶研究所標本室，相關信息見表1。

綠原酸標準品（110753-200413，98%），購于中國食品藥品檢定研究院。endprint

提取用甲醇和磷酸為分析純（廣州化學試劑公司），色譜分析用甲醇和乙腈為色譜純（Sigma，美國），去離子水。

1.2 ?主要儀器

2695-2487型高效液相色譜儀（Waters，美國）

1.3 ?方法

1.3.1 ?材料采集 ?分別采集不同產地苦丁茶冬青野生和栽培材料葉片各8批，每批野生材料分為3類（幼嫩葉、功能葉和老葉）;栽培材料只采集功能葉。新鮮葉片材料于50 ℃干燥后室溫放置;2月后再分別采集6種冬青屬植物栽培材料的新鮮功能葉，其中苦丁茶冬青來源于樣品9。隨即將上述不同時段采集的樣品同時分析。

1.3.2 ?樣品前處理 ?取樣品于50 ℃烘干，粉碎后過24目篩備用。稱取1.000 g左右樣品，置具塞三角瓶中，加入50%（V/V，下同）甲醇20 mL，稱定重量。超聲提取（40 kHz，180 W）30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，50%甲醇洗滌2～3次，取續濾液置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻。精密吸取600 μL于4 mL離心管，于0.22 μm微孔濾膜過濾后，待測。

1.3.3 ?標準品的配制 ?稱取綠原酸標準品10.4 mg于10 mL棕色量瓶內，用甲醇（色譜純）溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.04 mg/mL標準品貯備液，10 ℃保存，待用。

1.3.4 ?色譜分析 ?在預試驗基礎上，參照文獻[10]色譜條件：采用XBridge C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）為固定相，以乙腈-0.06%磷酸（V/V=1/9）為流動相;流速1.0 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫30 ℃。

1.3.5 ?方法學分析 ?根據回歸分析得到綠原酸濃度標準曲線，RP-HPLC方法系統適用性、精度及重復性試驗參照文獻[10]。

2 ?結果與分析

2.1 ?方法學分析

綠原酸標準品和樣品色譜圖分別見圖1和圖2。在上述色譜條件下，理論塔板數按綠原酸計算不低于1 000，樣品中的綠原酸不受雜質干擾。

對不同濃度標準品進行測定，計算綠原酸的標準曲線為Y=4×107X-125 553（r=0.996 9），吸取適量標準品溶液，連續進樣5次，測得峰面積RSD為0.36%（n=5），表明儀器精密度良好。穩定性試驗中，各峰面積RSD=0.8%（n=5），表明樣品溶液在8 h內穩定，重復性結果表明峰面積RSD=1.13%（n=5），即方法重復性較好。

2.2 ?功能葉中綠原酸含量的比較

綠原酸含量測定時各材料測量均重復5次，冬青屬苦丁茶栽培樣品新鮮功能葉中綠原酸含量見圖3。由圖3可知，苦丁茶冬青所含綠原酸的質量百分含量（以下簡稱含量）最高（0.58%），霍山冬青、大葉冬青、五棱苦丁茶及華中枸骨所含綠原酸含量次之，枸骨葉中的綠原酸含量最低。

2.3 ?不同發育階段葉片中綠原酸含量的比較

經低溫干燥處理，室溫密封保存2月后，各產地的苦丁茶冬青野生樣品在不同發育時期葉片（老葉、功能葉、幼葉）中的綠原酸含量見圖4，除樣品7和8外，都是老葉中的綠原酸含量大于功能葉，綠原酸含量最高者為樣品2，含量達0.26%。

2.4 ?不同產地野生與栽培材料功能葉中綠原酸含量的比較

經干燥處理，室溫放置2個月后，各產地的苦丁茶冬青野生與栽培材料功能葉中的綠原酸含量見圖5。由圖5可知，整體上野生材料中的綠原酸含量要高于栽培材料，但在栽培樣品中，14號樣品的綠原酸含量最高（0.12%），樣品15含量最低（0.05%）;在野生樣品中，5號樣品含量最高（0.08%）。

另外，由圖3與圖5的比較可知，苦丁茶冬青新鮮功能葉所含綠原酸含量是低溫處理放置2個月樣品含量的9倍。

3 ?討論

苦丁茶冬青是應用最廣泛的冬青屬苦丁茶。就綠原酸含量而言，以苦丁茶冬青的綠原酸含量最高，霍山冬青次之。比較已報道的冬青屬苦丁茶中的齊墩果酸和熊果酸含量，霍山冬青也位列第二[11]，因此霍山冬青是一種值得開發的冬青屬苦丁茶種質資源。另外，上述結果表明野生樣品中綠原酸含量整體上要高于栽培樣品。這種現象可能與其產地或遺傳因素有關，為選育苦丁茶良種提供了參考。

綠原酸是多酚類化合物，分子中含有酯鍵、不飽和雙鍵及多酚3個不穩定結構，因此其儲藏條件將直接影響綠原酸在葉中的含量。通過比較新鮮葉片和室溫密閉放置2個月后葉片中的綠原酸含量，發現后者所含的綠原酸含量急劇下降。因此傳統苦丁茶工藝中的“殺青”措施，對于抑制鮮葉中多酚化合物的酶促氧化反應十分必要。另外老葉所含的綠原酸含量較高，可能與其感染了菌類，呼吸作用強烈從而促進綠原酸的合成相關。

綜上所述，冬青屬苦丁茶不同樣品中的綠原酸含量差異較大，這可能與物種，基因型或者種質材料的所在地域相關;苦丁茶冬青作為冬青屬苦丁茶的主流種類，是人工栽培面積最大和產量最高的冬青屬苦丁茶種類，可考慮從其種質資源庫中篩選出一些富含綠原酸且綜合性狀良好的種質資源材料，通過組培或扦插等無性繁殖手段加速繁殖，盡快培育出富含綠原酸且高產優質的新品系或新品種，并在生產上大面積推廣種植，進而通過綠原酸延伸和擴展苦丁茶冬青的產業鏈，從而進一步提高苦丁茶產業的經濟效益。

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