小麥DREB基因的克隆及植物表達載體構建

于月華+張躍強+倪志勇+海熱古力·阿不力孜

摘要：脫水應答元件結合蛋白在高等植物應答干旱、高鹽和低溫脅迫中發揮重要的作用。根據GenBank中小麥（Triticum aestivum L.）DREB基因的cDNA序列設計引物，采用RT-PCR技術從小麥中克隆了DREB基因837 bp的編碼區。為進一步研究小麥DREB基因的功能，以pMD18-T-DREB質粒為模板，PCR擴增DREB基因片段，構建了該基因的植物表達載體。經菌液PCR和測序鑒定后，轉化到農桿菌LBA4404中，為通過轉基因技術深入研究小麥DREB基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：植物表達載體;小麥（Triticum aestivum L.）;DREB基因

中圖分類號：Q78 ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2925-03

Cloning of DREB Gene of Triticum aestivum and Construction of Its Plant Expression Vectors

YU Yue-hua1， ZHANG Yue-qiang2， NI Zhi-yong1， HAIREGULI·ABULIZI2

（1. College of Agronomy/Key Laboratory of Agricultural Biological Technology， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China;

2. Institute of Nuclear and Biological Technologies， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China）

Abstract： Dehydration-responsive element binding protein played critical roles in the response to dehydration， salinity， and cold stresses in higher plants. Primers were designed according to the cDNA sequence of wheat DREB gene in Genbank， a length of 837 bp from cDNA of DREB gene was cloned by RT-PCR. To investigate the function of DREB gene in wheat，the plant expression vector of DREB gene was constructed. The full-length open reading frame of DREB gene was amplified by PCR using pMD18-T-DREB as template. PCR and sequencing results showed that plant expression vector of DREB gene was constructed successfully. This constructed vector was then transformed into Agrobacterium LBA4404. This constructed vector provided an effective tool for the further study of DREB gene function.

Key words： plant expression vector; wheat（Triticum aestivum L.）; DREB gene

高等植物中脫水應答元件結合蛋白（Dehydration-responsive element binding protein，DREB）在應答脫水、高鹽和冷脅迫中具有重要的作用[1，2]。DREB轉錄因子通過結合目標基因啟動子區域中的脫水應答元件DREs/CRTs，提高轉基因植物對干旱、高鹽和冷脅迫的耐受性[3，4]。通過在模式植物中過表達DREB基因，已經揭示了許多植物的DREB基因在逆境脅迫應答中的作用[5]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達大麥（Hordeum vulgare L.）HvDREB1基因，在正常生長條件下激活下游基因RD29A的表達，提高轉基因擬南芥對鹽脅迫的忍耐能力[6]。過表達水稻（Oryza sativa L.）OsDREB1A基因的轉基因擬南芥植物，在正常生長條件下激活目標基因的表達，提高轉基因植物對干旱和低溫的耐受性[7]。過表達大豆（Glycine max Merr.）GmDREB2基因提高轉基因植物對干旱和高鹽的忍耐能力[8]。因此，通過控制DREB轉錄因子的表達有可能提高多種作物對非生物脅迫的忍耐能力[9]。目前，已經從許多植物中克隆了DREB基因，包括水稻[7]、玉米（Zea mays L.）[10]、大豆[8]和小麥（Triticum aestivum L.）[11，12]。

小麥是中國乃至全世界最重要的糧食作物之一[13]，中國小麥主產區主要分布在干旱、半干旱地區，提高小麥對干旱脅迫的耐受性來增加小麥產量，將極大地提高中國應對糧食安全問題的能力。本研究根據GenBank中的小麥DREB基因序列，設計帶有酶切位點的引物，從新春6號小麥品種中克隆了DREB基因，構建了植物表達載體，并轉入農桿菌LBA4404中，為進一步利用農桿菌介導法轉化小麥奠定了基礎。endprint

1 ?材料和方法

1.1 ?材料

供試小麥品種為新春6號，由新疆農業科學院核技術生物技術研究所小麥育種課題組提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA的提取及cDNA的合成 ?生長10 d 新春6號小麥幼苗經20%聚乙二醇（PEG）處理6 h后取樣，參照Trizol試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]使用說明，提取經PEG處理的小麥葉片總RNA。利用AMV反轉錄酶[寶生物工程（大連）有限公司]反轉錄合成cDNA第一鏈。取1 μg總RNA作為模板進行RT-PCR，20 μL體系中包含總RNA 1 μg，DEPC水6.5 μL，Olig（dT）15 1 μL，75 ℃保溫5 min后，冰上冰浴5 min，然后依次加入0.5 μL RNase inhibitor，4 μL 5×AMV Buffer，2 μL dNTPs（10 mmol/L）和1 μL AMV（100 U/μL），25 ℃保溫10 min，42 ℃溫育90 min，95 ℃變性5 min，冰上冰浴5 min。

1.2.2 ?小麥DREB基因編碼區的克隆 ?根據GenBank中的小麥DREB基因序列（登錄號：AY781361）和植物表達載體pCAMBIA3301的酶切位點設計合成一對帶有限制性內切酶的引物DREB-F：5′-TAACCATGGATGGAGACCGGGGGTAGCAA-3′和DREB-R：5′-TATAGATCTCTAATATGAGAAAAGACTAAA-3′（下劃線分別為Nco I和Bgl II酶切位點），以20% PEG處理6 h的葉片cDNA第一鏈為模板，擴增基因編碼區。50 μL體系中含cDNA（20 ng/μL） 1 μL，2×GC-PCR Buffer II 25 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，引物（25 μmol/L） 1 μL和LA Taq酶（5 U/μL）0.5 μL[寶生物工程（大連）有限公司]，補ddH2O至50 μL。PCR 程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，66 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用紫外凝膠成像儀（Bio-Rad公司）觀察結果。采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]回收目的片段，將回收產物與pMD18-T[寶生物工程（大連）有限公司]載體連接后轉化E. coli DH5α感受態細胞[天根生化科技（北京）有限公司]，與X-gal和IPTG涂于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，過夜培養后挑取白色克隆，經含有氨芐青霉素的液體培養基振蕩培養12 h。菌液PCR檢測是否有插入片段，并陽性克隆送上海美季生物技術公司測序，采用DNAMAN軟件分析比對測序結果。

1.2.3 ?小麥DREB基因表達載體的構建及鑒定 ?以含有小麥DREB基因編碼區的pMD18-T-DREB質粒為模板，使用DREB-F和DREB-R引物，用高保真酶[寶生物工程（大連）有限公司]擴增兩端帶有Nco I和Bgl II酶切位點的小麥DREB基因編碼區序列。PCR擴增體系和擴增程序同上。獲得的小麥DREB基因PCR產物，凝膠回收后，用Nco I和Bgl II（Fermentas公司）酶切PCR回收產物和表達載體pCAMBIA3301質粒。50 μL體系中包含：質粒或PCR產物（5 μg）10 μL，Nco I 5 μL，Bgl II 5 μL，10×Fast Digest Buffer 5 μL和ddH2O 25 μL?；厥针p酶切產物，用T4 DNA連接酶（Fermentas公司）將DREB片段連接到pCAMBIA3301載體中，22 ℃孵育10 min。連接產物轉化E. coli DH5α感受態細胞[天根生化科技（北京）有限公司]。菌液PCR鑒定構建的DREB基因植物表達載體，并將陽性克隆送上海美季生物技術公司測序。

1.2.4 ?小麥DREB基因表達載體轉化農桿菌 ?LBA

4404提取小麥DREB基因表達載體pCAMBIA3301-DREB的質粒，以凍融法將質粒轉化農桿菌LBA4404感受態細胞。具體方法參照倪志勇等[14]的方法。

2 ?結果與分析

2.1 ?小麥DREB基因編碼區的克隆及序列比對

根據GenBank中的小麥DREB基因序列（登錄號：AY781361），設計一對帶有酶切位點的引物，用RT-PCR方法從經20% PEG處理6 h的新春6號小麥葉片中擴增到DREB基因的編碼區，擴增片段大小為837 bp（圖1）。將擴增片段連接到克隆載體pMD18-T，測序后與GenBank中的小麥DREB基因序列進行比對，結果表明兩個序列完全一致，說明獲得的小麥DREB基因編碼區是正確的，沒有發生堿基變化，可以用來構建植物表達載體。

2.2 ?小麥DREB基因表達載體的構建

用前向帶有Nco I和反向帶有Bgl II酶切位點的小麥DREB基因引物，以pMD18-T-DREB質粒為模板，經PCR擴增獲得兩端帶有Nco I和Bgl II酶切位點的小麥DREB基因編碼區片段，擴增產物大小約837 bp，與預期大小相符，且無非特異擴增帶。將目的片段回收純化后，用Nco I和Bgl II酶切，連接到用相同酶切回收后的表達載體pCAMBIA3301上，熱激轉化E. coli DH5α，獲得pCAMBIA3301-DREB表達載體（圖2）。對重組質粒用DREB-F和DREB-R引物進行PCR鑒定，能夠擴增出一條長約837 bp的目的基因條帶（圖3）。將陽性克隆測序，序列比對結果正確，說明小麥DREB基因表達載體構建成功。endprint

2.3 ?小麥DREB基因表達載體轉化農桿菌LBA4404

將構建好的植物表達載體pCAMBIA3301-DREB通過凍融法導入農桿菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素進行篩選，待轉化子菌落長出后，挑取單菌落搖菌，采用DREB-F和DREB-R引物進行農桿菌菌液PCR鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖4可以看出，能夠從轉化表達載體的農桿菌菌液中獲得大小為837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表達載體已成功轉入農桿菌LBA4404中，可直接用于后續的小麥轉化工作。

3 ?小結與討論

新春6號小麥品種對高溫和干旱的抗性較強，是新疆春小麥超高產品種[15]。為了獲得抗旱性基因，本研究根據GenBank中小麥DREB基因的序列，從新疆小麥品種新春6號中克隆了該基因的編碼區序列，序列比對發現獲得的DREB編碼區序列與GenBank中的小麥DREB基因序列完全一致，沒有發生堿基的變化。將該編碼區序列克隆到植物表達載體pCAMBIA3301中并轉化農桿菌LBA4404中，為使用農桿菌浸染的方法轉化小麥品種打下基礎。

參考文獻：

[1]LIU Q，KASUGA M，SAKUMA Y，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expression， respectively，in Arabidopsis[J].Plant Cell，1998，10（8）：1391-1406.

[2] AGARWAL P K，AGARWAL P，REDDY M K，et al.Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants[J].Plant Cell Rep，2006，25（12）：1263-1274.

[3] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K.A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，low-temperature，or high-salt stress[J].Plan Cell，1994，6（2）：251-264.

[4] BAKER S S，WILHELM K S，THOMASHOW M F.The 5-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting eleme ntsthat confer cold，drought-and ABA-regulated gene expression [J].Plant Molecular Biology，1994，24（5）：701-713.

[5] 倪志勇，徐兆師，李連城，等.DREB轉錄因子在植物抗逆脅迫中的作用機理及應用研究進展[J].麥類作物學報，2008，28（6）：1100-1106.

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[13] VASIL T K，ANDERSON O D.Genetic engineering of wheat gluten[J].Trends Plant Sci，1997，2（8）：292-297.

[14] 倪志勇，馬文靜，呂 ?萌，等. 棉花肉桂醇脫氫酶基因GhCAD6的克隆及正義、反義與RNAi干擾載體的構建[J].華北農學報，2009，24（6）：20-26.

[15] 吳振錄. 新疆春小麥超高產育種及超高產品種新春6號的育成[J].新疆農業科學，1994（2）：57-59.endprint

2.3 ?小麥DREB基因表達載體轉化農桿菌LBA4404

將構建好的植物表達載體pCAMBIA3301-DREB通過凍融法導入農桿菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素進行篩選，待轉化子菌落長出后，挑取單菌落搖菌，采用DREB-F和DREB-R引物進行農桿菌菌液PCR鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖4可以看出，能夠從轉化表達載體的農桿菌菌液中獲得大小為837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表達載體已成功轉入農桿菌LBA4404中，可直接用于后續的小麥轉化工作。

3 ?小結與討論

新春6號小麥品種對高溫和干旱的抗性較強，是新疆春小麥超高產品種[15]。為了獲得抗旱性基因，本研究根據GenBank中小麥DREB基因的序列，從新疆小麥品種新春6號中克隆了該基因的編碼區序列，序列比對發現獲得的DREB編碼區序列與GenBank中的小麥DREB基因序列完全一致，沒有發生堿基的變化。將該編碼區序列克隆到植物表達載體pCAMBIA3301中并轉化農桿菌LBA4404中，為使用農桿菌浸染的方法轉化小麥品種打下基礎。

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[15] 吳振錄. 新疆春小麥超高產育種及超高產品種新春6號的育成[J].新疆農業科學，1994（2）：57-59.endprint

2.3 ?小麥DREB基因表達載體轉化農桿菌LBA4404

將構建好的植物表達載體pCAMBIA3301-DREB通過凍融法導入農桿菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素進行篩選，待轉化子菌落長出后，挑取單菌落搖菌，采用DREB-F和DREB-R引物進行農桿菌菌液PCR鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖4可以看出，能夠從轉化表達載體的農桿菌菌液中獲得大小為837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表達載體已成功轉入農桿菌LBA4404中，可直接用于后續的小麥轉化工作。

3 ?小結與討論

新春6號小麥品種對高溫和干旱的抗性較強，是新疆春小麥超高產品種[15]。為了獲得抗旱性基因，本研究根據GenBank中小麥DREB基因的序列，從新疆小麥品種新春6號中克隆了該基因的編碼區序列，序列比對發現獲得的DREB編碼區序列與GenBank中的小麥DREB基因序列完全一致，沒有發生堿基的變化。將該編碼區序列克隆到植物表達載體pCAMBIA3301中并轉化農桿菌LBA4404中，為使用農桿菌浸染的方法轉化小麥品種打下基礎。

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[5] 倪志勇，徐兆師，李連城，等.DREB轉錄因子在植物抗逆脅迫中的作用機理及應用研究進展[J].麥類作物學報，2008，28（6）：1100-1106.

[6] XU Z S，NI Z Y，LI Z Y，et al.Isolation and functional characterization of HvDREB1-a gene encoding a dehydration-responsive element binding protein in Hordeum vulgare[J].J Plant Res，2009，122（1）：121-130.

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[8] CHEN M，WANG Q Y，CHENG X G，et al.GmDREB2，a soybean DRE-binding transcription factor，conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，353（2）：299-305.

[9] 劉 ?強，趙南明，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，等.DREB轉錄因子在提高植物抗逆性的作用[J].科學通報，2000，45（1）：11-16.

[10] QIN F，SAKUMA Y，LI J，et al.Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L.[J].Plant Cell Physiol，2004，45（8）：1042-1052.

[11] 倪志勇，徐兆師，劉 ?麗，等.小麥轉錄因子TaDREB6基因的克隆及鑒定[J].麥類作物學報，2008，28（3）：357-363.

[12] XU Z S， NI Z Y， LIU L， et al. Characterization of the TaAIDFa gene encoding a CRT/DRE-binding factor responsive to drought， high-salt， and cold stress in wheat[J]. Mol Genet Genomics，2008，280（6）：497-508.

[13] VASIL T K，ANDERSON O D.Genetic engineering of wheat gluten[J].Trends Plant Sci，1997，2（8）：292-297.

[14] 倪志勇，馬文靜，呂 ?萌，等. 棉花肉桂醇脫氫酶基因GhCAD6的克隆及正義、反義與RNAi干擾載體的構建[J].華北農學報，2009，24（6）：20-26.

[15] 吳振錄. 新疆春小麥超高產育種及超高產品種新春6號的育成[J].新疆農業科學，1994（2）：57-59.endprint