實(shí)驗(yàn)教學(xué)中生物光學(xué)顯微鏡的常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法

嚴(yán)家來(lái)，孟德娣，張建軍，陳雨京，朱先梅，張發(fā)蘇

（安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，安徽 合肥 230601）

生物光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，是一種重要的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)備，對(duì)于形態(tài)學(xué)觀察至關(guān)重要。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在醫(yī)學(xué)專業(yè)開(kāi)設(shè)的病理學(xué)、組織胚胎學(xué)、臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)、寄生蟲(chóng)學(xué)檢驗(yàn)、血液學(xué)檢驗(yàn)、微生物學(xué)檢驗(yàn)及診斷學(xué)等涉及形態(tài)學(xué)課程中，實(shí)驗(yàn)教學(xué)使用顯微鏡的頻率極高。能夠熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)并熟練使用和維護(hù)好顯微鏡，是學(xué)生上好形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)課的前提[1]。筆者根據(jù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體會(huì)，對(duì)生物光學(xué)顯微鏡使用過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法進(jìn)行分析。

1 顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)

雙目電光源生物顯微鏡基本結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1[2]。熟悉顯微鏡結(jié)構(gòu)是規(guī)范、熟練使用，克服、解決問(wèn)題的基礎(chǔ)。

圖1 顯微鏡的結(jié)構(gòu)

2 顯微鏡的主要性能

2.1 定位精度

指一物鏡處在工作狀態(tài)，用轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)至另一物鏡時(shí)，視野中心的偏移量。如用10×物鏡調(diào)焦后，以其中心為基準(zhǔn)，再轉(zhuǎn)換至40×物鏡時(shí)，中心位移不得超過(guò)該視場(chǎng)半徑的2/3，以40×物鏡為基準(zhǔn)，轉(zhuǎn)換至100×物鏡時(shí)，中心位移不得超過(guò)該視場(chǎng)半徑的3/4。

2.2 齊焦精度

指一個(gè)物鏡調(diào)焦在工作位置后，轉(zhuǎn)換到其他物鏡時(shí)，應(yīng)在不重新調(diào)焦的情況下就能看到物像。

2.3 焦點(diǎn)深度

指視野中垂直范圍內(nèi)所能清晰觀察到的物象界限。當(dāng)不用微調(diào)就能看清楚一個(gè)物像的平面及上下結(jié)構(gòu)，這個(gè)能夠看清的厚度即焦點(diǎn)深度。

2.4 鏡口率

指光線從聚光鏡經(jīng)載玻片折射后所成光線底面的孔徑數(shù)值，又稱數(shù)值孔徑。同樣條件下，放大倍數(shù)越大，鏡口率越低，光線越暗。

2.5 視野亮度

為了得到足夠視野亮度，必須用強(qiáng)光源并開(kāi)大光柵，使充足的光源進(jìn)入物鏡。同樣條件下，物鏡頭放大倍數(shù)越大，鏡口率越高，進(jìn)入光線越少。因此，轉(zhuǎn)換物鏡頭時(shí)應(yīng)注意調(diào)整光線強(qiáng)度，使用油鏡頭時(shí)一定要添加香柏油。聚光鏡抬高接近物鏡頭可以增加亮度，如果亮度已經(jīng)足夠甚至過(guò)剩，可以縮小光圈，或者下調(diào)聚光鏡，但一般不降低底座光源強(qiáng)度，因?yàn)闀?huì)使光源的顏色由白變黃，失去自然光屬性，改變物像的顏色。下調(diào)聚光鏡不僅可以降低亮度，還可以增加物像的對(duì)比度，使物像層次清晰。

3 顯微鏡使用三大原則

即先上后下，先高后低，先粗后細(xì)：（1）載物臺(tái)的高度從上往下調(diào)節(jié)，可避免壓碎載玻片；（2）物鏡頭轉(zhuǎn)換先低倍鏡后高倍鏡，便于定位目標(biāo)；（3）先用粗調(diào)節(jié)螺旋找到大致的焦點(diǎn)范圍，再用細(xì)調(diào)節(jié)螺旋調(diào)節(jié)清晰的物像。

4 顯微鏡使用的常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法

4.1 光源燈不亮

電光源顯微鏡的好處是借助于底座強(qiáng)烈的光線把標(biāo)本照亮，經(jīng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)可以清楚看到物像，但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)故障。光源燈不亮原因在于：（1）電源沒(méi)接通；（2）插座插頭未插好；（3）開(kāi)關(guān)未開(kāi)；（4）調(diào)節(jié)閥未開(kāi)；（5）燈泡損壞；（6）保險(xiǎn)絲損壞等。

解決辦法：（1）使用帶指示燈的電源插座，每次使用顯微鏡之前仔細(xì)檢查是否接通電源。（2）將電源開(kāi)關(guān)置于閉合狀態(tài)，指示為“開(kāi)”字或“ON”字。（3）檢查調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度（volume）的旋鈕是不是處于最小處（minimum），一般此調(diào)節(jié)鈕都是處于最高檔，光源發(fā)出白色光。（4）底座光源的燈泡使用壽命較短，工作時(shí)間久了會(huì)自然損壞，應(yīng)注意更換燈泡。養(yǎng)成隨手關(guān)閉光源的習(xí)慣，使用前打開(kāi)，不需預(yù)熱，間隔5分鐘以上不用就要關(guān)閉電源。（5）如果使用帶延長(zhǎng)線電源的插板，宜選用優(yōu)質(zhì)品牌，最好帶通電開(kāi)關(guān)和指示燈。（6）保險(xiǎn)絲燒斷，更換保險(xiǎn)絲。

4.2 找不到物像

4.2.1 標(biāo)本不在工作距離范圍內(nèi) 解決辦法：調(diào)高載物臺(tái)，載玻片與物鏡頭相接，慢慢下調(diào)，防止向下調(diào)節(jié)過(guò)快，沒(méi)有捕捉到物像。

4.2.2 目標(biāo)不在視野范圍內(nèi) 解決辦法：（1）血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤的劃線區(qū)域一定要對(duì)準(zhǔn)物鏡頭；（2）較少的標(biāo)本，涂片區(qū)域較小，觀察時(shí)要注意不要超出涂片范圍。

4.2.3 光線過(guò)于強(qiáng)烈或太暗 解決辦法：光線過(guò)于強(qiáng)烈，視野物像被“曝光”呈白色，適當(dāng)降低光線強(qiáng)度，物像就會(huì)慢慢呈現(xiàn)出來(lái)。反之，用暗視野觀察物像時(shí)，注意避免物像被黑暗掩蓋。

4.2.4 聚光器偏離光軸 解決辦法：進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)使光線在目鏡、物鏡、聚光鏡、光柵這一光路的中心。

4.2.5 標(biāo)本放反 在觀察細(xì)胞形態(tài)時(shí)，如白細(xì)胞分類通常使用油鏡觀察，但血涂片經(jīng)染色后，有的學(xué)生會(huì)把標(biāo)本反放在載物臺(tái)上。因?yàn)橛顽R頭鏡口率較小，需要標(biāo)本非常接近油鏡頭，如果放反，物體超出了顯微鏡工作距離，無(wú)論如何也找不到物像。解決方法：（1）發(fā)現(xiàn)載玻片放反，直接翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)；（2）在制作載玻片時(shí)在其一端做標(biāo)記，防止觀察時(shí)放反。

4.2.6 觀察到的物像不見(jiàn)了 雖然使用顯微鏡能觀察到所要的物像，但一段時(shí)間后，卻找不到剛才的物像。此時(shí)有兩種情況：（1）顯微鏡的焦距仍正確，即視野內(nèi)其他物像仍清晰；（2）顯微鏡的焦距發(fā)生了改變，視野中不再有任何清晰的物像。解決方法：出現(xiàn)第一種情況的原因是臨時(shí)標(biāo)本中的水較多，或顯微鏡鏡身傾斜角度過(guò)大，或者兩者兼而有之，使得標(biāo)本中的物體在重力作用下向下移動(dòng)，離開(kāi)了視野范圍。此時(shí)可以稍微向上調(diào)節(jié)載物臺(tái)的高度，并將鏡身直立。出現(xiàn)第二種情況的原因可能是由于粗準(zhǔn)焦螺旋軸上的齒輪與鏡筒上的齒條磨損松動(dòng)，造成鏡筒自動(dòng)下滑，需要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員修理。

4.3 視物模糊

視物模糊是由于光學(xué)系統(tǒng)受到污染，首先要判斷出污物存在的位置，才能有效排除。視野中出現(xiàn)異物有3種情況：物鏡上、目鏡上和載玻片上。（1）移動(dòng)載玻片異物不動(dòng)，說(shuō)明污物不在載玻片上；（2）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，換上高倍鏡后，仍可觀察到，說(shuō)明污物不在物鏡上，只可能存在于目鏡上；（3）如果轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡頭，污物也隨之轉(zhuǎn)動(dòng)，則說(shuō)明在目鏡頭上。

4.3.1 目鏡頭污染 解決辦法：用乙醚乙醇混合液擦拭鏡頭表面，直到消除。如果是內(nèi)部污染，則應(yīng)謹(jǐn)慎，這多是由于不慎打開(kāi)目鏡頭，灰塵、水汽進(jìn)入造成，可以用干燥的紗布擦拭或洗耳球吹洗。平時(shí)注意保持室內(nèi)干燥，防塵，避免從低溫環(huán)境直接進(jìn)入高溫環(huán)境，防止形成冷凝水，發(fā)生霉變。

4.3.2 物鏡頭污染 解決辦法：（1）標(biāo)本加樣不可太多，否則堆積在一起厚度較大，可以攤開(kāi)平鋪，擴(kuò)大面積，也易于尋找，避免目標(biāo)重疊；（2）在不違反規(guī)則的情況下用低倍鏡觀察，因?yàn)槭褂玫捅剁R時(shí)，物鏡頭距離觀察目標(biāo)尚有一段安全距離，可以避免標(biāo)本接觸物鏡頭；（3）加蓋蓋玻片，并且保持蓋玻片上方面的干燥；（4）油浸鏡頭使用后應(yīng)用擦鏡紙蘸二甲苯及時(shí)擦拭，如果干結(jié)，清潔難度較大，應(yīng)用擦鏡紙沾濕清潔液浸潤(rùn)，擦拭時(shí)要用力。

4.4 機(jī)械故障

4.4.1 載物臺(tái)卡死 有些顯微鏡的高倍物鏡等焦處理不過(guò)關(guān)，導(dǎo)致在低倍鏡下看清物像轉(zhuǎn)換到高倍鏡時(shí)，高倍鏡與載玻片相碰，無(wú)法使用高倍鏡[3]。解決方法：打開(kāi)粗調(diào)節(jié)螺旋，將載物臺(tái)上升到最高處，重新擰緊。

4.4.2 壓碎玻片 當(dāng)載物臺(tái)上升到一定高度，載玻片與鏡頭“親密接觸”，已經(jīng)超過(guò)了物鏡頭的彈性范圍，最先受傷的只能是載玻片。解決辦法：遵循載物臺(tái)高度調(diào)節(jié)先上后下原則即可避免。

4.4.3 目鏡頭眼間距過(guò)小，不能雙眼觀察 出現(xiàn)這種情況主要是個(gè)別人眼間距太小，不能適應(yīng)正常擺放的顯微鏡的目鏡頭的眼間距，但目鏡頭進(jìn)一步縮小受鏡架的阻擋，不能雙眼觀察。解決辦法：可以把固定目鏡的螺栓松動(dòng)后旋轉(zhuǎn)180°，重新固定，進(jìn)一步縮小兩目鏡頭的距離，適合眼間距窄的學(xué)生使用。

學(xué)生在使用顯微鏡的過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題在所難免，教師的任務(wù)是教會(huì)學(xué)生使用方法。除了在學(xué)生使用顯微鏡過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)并加以解決外，實(shí)驗(yàn)室工作人員對(duì)顯微鏡使用的登記管理及日常維護(hù)也是非常必要的[4，5]。