海洛因對人T淋巴細胞線粒體產能代謝的影響

付青梅 張永創 張永春 卜英博 謝淼 王茜

（1.武警貴州省總隊醫院；2.武警貴州省總隊醫院藥劑科；3.武警貴州省總隊醫院外二科；4.武警

貴州省總隊醫院設備科；5.武警貴州省總隊醫院檢驗科；6.武警貴州省總隊醫院內二科，貴州 貴陽550005）

海洛因吸食在世界范圍內已成為一種嚴重的社會公共衛生問題，海洛因、嗎啡等阿片類毒品長期濫用可引起細胞變性、壞死，其對人體細胞免疫功能的損傷已被證實［1］。目前針對海洛因吸食的研究眾多，但對海洛因吸食者T淋巴細胞線粒體產能代謝功能的報道甚少，且大部分為體外細胞培養的研究。故本實驗從不同海洛因吸食年限患者體內抽取外周血，提取T淋巴細胞，對其進行相關指標的檢測，旨在從線粒體層面探討海洛因對人T淋巴細胞線粒體產能代謝的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為武警貴州省總隊醫院戒毒中心選擇的100例青、中年男性海洛因吸食者，抽取其外周血備用；無鈣、鎂離子的平衡鹽溶液（DHank’s液，pH7.2～7.4）；淋巴細胞分離液（天津市TBD生物技術發展中心產品）；RPMI 1640培養基（GIBCO產品）；小牛血清（華西醫科大學生產）；尼龍棉（上海化纖九廠）；MTT（Sigma公司）。

1.2 實驗方法 實驗方法如下。

1.2.1 實驗分組 從我院戒毒中心隨機選擇100例男性青中年海洛因吸食者，據入院前的綜合體檢，排除其他疾病；根據海洛因吸食時間，將受試對象分為2年、5年、8年3個組別，實驗前告知所有受試對象該研究的目的和意義，并選擇20例健康成年男性的外周血作為對照。3組患者的選擇標準為20～25歲（年齡標準差在±6.21以內）的吸毒者，且排除其他系統性疾病，無慢性病史。

1.2.2 外周血單個核細胞（PBMCs）的分離 采用密度梯度離心法，取新鮮上述組別外周血，用DHank’s液稀釋2～3倍，充分混勻后用無菌毛細吸管吸取5～6mL稀釋的細胞懸液沿管壁小心緩慢地加入預先已裝有3mL淋巴細胞分離液的10mL離心管內，水平式轉頭2 000 r／min離心20min，絕大多數PBMCs懸浮于血漿與分層液界面上，將此層移入另一試管。用5倍以上體積的D－Hank’s液充分 洗 滌，1 600 r／min 離 心 8min，棄 上 清；1 000 r／min離心10min，棄上清液，以去除混雜的血小板，所得PBMCs重懸于含100mL／L胎牛血清蛋白（FCS）的RPMI 1640培養基中備用。

1.2.3 PBMCs中淋巴細胞和單核巨噬細胞的分離采用玻璃器黏附法，將分離的PBMCs細胞數調至2×106個／mL，置于120mm玻璃培養瓶內，充分搖晃混勻，于50mL／L CO2孵箱中37℃靜置60～90min后，以毛細吸管小心輕吸未黏附之細胞懸液，即為去除單核細胞的淋巴細胞懸液。

1.2.4 T淋巴細胞的分離純化 采用尼龍棉柱濾過法，尼龍棉以0.2mol／L HCl浸泡6h，再用大量蒸餾水反復沖洗，晾干。稱取尼龍棉50mg將其裝填入10mL注射器內，高壓滅菌。尼龍棉柱高度為6cm，可有效地過濾（2～3）×107個細胞。用DHank’s液和含200mL／L FCS的RPMI 1640培養基洗柱各2次，以平衡pH、溫度、排除空氣，37℃放置1h。上柱前先將平衡液放出，加入細胞數為2×107個／mL的淋巴細胞懸液0.5mL，平放尼龍棉柱，以細長的毛細滴管伸入柱內界面加入培養液0.5mL封口，將柱于37℃靜置孵育1h。用預溫的培養液淋洗柱2～3次，流速控制在1mL／min，收集最初的10mL流出液，1 300 r／min離心10min，計數并調整細胞數，此即分離純化T淋巴細胞。

1.2.5 T淋巴細胞的培養 將分離的T淋巴細胞培養于含200mL／L FCS、2mmol／L 谷氨酰胺、20mmol／L N－2－羥 乙 基 哌 嗪－N’－2－乙 烷 磺 酸（HEPES）、100U／mL青霉素、100U／mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養基中，調整細胞數為1×106個／mL。

1.2.6 MTT法檢測細胞生長情況 將分離所得的T淋巴細胞按2×105個／mL接種于24孔細胞培養板中；加入上述培養基1.5mL培養4h后，部分轉入96孔板內（104個／孔），48h后小心吸取孔內培養基，每孔加入80μL無血清培養基和20μL MTT溶液（5μg／L），繼續培養4h。小心吸取孔內液體，每孔加150μL二甲基亞砜，低速震蕩10min后，用酶標儀檢測490nm處的吸光度值。吸光度值反映細胞增殖活性，其高低與細胞增殖活性成正比。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞經培養后，用不含EDTA的胰酶消化后離心收集細胞，每樣本細胞數約為2.5×106個，棄培養基，使用PBS洗滌細胞2次，分別依次加入500μL Binding Buffer、5μL Annexin V－FITC、5μL Propidium Iodide混勻，室溫避光反應15min后，使用流式細胞儀進行檢測。

1.2.8 細胞內ATP含量檢測 細胞處理后，消化離心收集細胞，加無血清培養基520μL混勻，加2%三氯醋酸520μL，冰浴5min，離心5min后取300μL上清與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）液300μL和磷酸甘油醛脫氫酶－磷酸甘油激酶10μL混合，經分光光度計檢測NADH下降的吸光度，據標準曲線查ATP值。

1.2.9 活性氧（ROS）的 DCFH－DA熒光探針檢測細胞分組處理后收集細胞，加入終濃度為10μmol／L的 DCFH－DA，于37℃ 培養箱中孵育30min。孵育結束后，用無血清培養基洗細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH－DA，再次收集細胞后，PBS重懸，用熒光分光光度汁測定2＇，7＇－二氯熒光黃（DCF）的熒光強度。檢測條件：激發波長488nm，發射波長525nm，激發和發射波長的光柵寬度均設為5nm。ROS含量與熒光強度呈正相關。

1.3 統計學處理 所有數據采用SPSS 19.0統計學軟件分析，計量資料以（ˉx±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同海洛因吸食年限者T淋巴細胞增殖活性對照組測得平均熒光強度值為（0.74±0.06），海洛因吸食2年者測得值為（0.57±0.04），吸食5年者測得值為（0.35±0.05），吸食8年者測得值為（0.27±0.02）。與對照組比較，隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細胞增殖活性逐漸降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 不同海洛因吸食年限者T淋巴細胞凋亡情況海洛因吸食對T淋巴細胞凋亡影響后Annexin V－FITC／PI雙染結果是對照組測得其細胞凋亡率為（6.20±1.14）%，海洛因吸食2年者測得值為（10.28±1.51）%，吸食5年者測得值為（22.17±2.13）%，吸食8年者測得值為（29.78±2.89）%。與對照組比較，隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細胞凋亡程度逐漸增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 不同海洛因吸食年限對T淋巴細胞內ATP產生的影響 對照組測得其T淋巴細胞線粒體的ATP含量為（0.136±0.021）mmol，海洛因吸食2年者測得其含量為（0.113±0.009）mmol，吸食5年者測得其含量為（0.083±0.008）mmol，吸食8年者測得其含量為（0.062±0.003）mmol。與對照組比較，隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細胞內ATP產生逐漸降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 DCFH－DA熒光探針檢測細胞內ROS的含量與各自對照組比較，隨著亞硒酸鈉劑量的增加，細胞DCF熒光強度逐漸減低。相同劑量亞硒酸鈉干預的不同組間比較，隨著海洛因吸食時間的增加，細胞DCF熒光強度呈現增高趨勢。說明亞硒酸鈉可使細胞ROS含量降低；而吸食海洛因可使細胞內

ROS含量升高。見表1。

表1 亞硒酸鈉對各組細胞內ROS的影響

3 討 論

有研究［2］發現海洛因吸食成癮可導致人體免疫功能受損，且海洛因成癮為造成細胞死亡的主要形式。早期報告亦指出，藥物濫用能抑制外周血T細胞的E－花環形成，毒品依賴者外周血T細胞減少，絲裂原誘導的T細胞增殖能力下降，同時，藥物濫用不僅對細胞增殖方面產生影響，其能使吸食者體內細胞超微結構發生明顯改變［3］。線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ又稱CoQ還原酶，復合物Ⅰ缺陷或者抑制導致線粒體內膜質子電化學梯度異常，ATP合成障礙以及增加氧自由基損傷，從而導致細胞凋亡。在前人的研究中有證明海洛因導致了生物狀態及抗氧化酶活性的變化，活性氧（ROS）和一些疾病有關，細胞在生理或者病理狀態下會產生ROS，當氧化和抗氧化的臨界平衡由于抗氧化劑耗盡和（或）過量的ROS堆積被打破時，氧化應激產生。ROS可以和一些大分子發生反應，如脂質，蛋白質，核酸，碳水化合物，特別是膜上的多不飽和脂肪酸。當ROS反應開始后，持續的鏈式反應會造成細胞損傷，最終細胞死亡［4］。有研究［5］表明，正常人與海洛因吸食患者外周血白細胞線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性，結果顯示兩組之間線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性有顯著差異，海洛因吸食者細胞線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性明顯低于正常對照組，因此，本研究從海洛因不同吸食年限的人群中，抽取外周血，提取T淋巴細胞，通過檢測細胞內ATP含量發現，隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細胞內ATP產生逐漸減少，這可能與海洛因吸食者線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性低于正常對照組有關，亦因線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ缺陷從而導致線粒體內膜質子電化學梯度異常，ATP合成障礙從而導致細胞凋亡；通過檢測各組細胞的凋亡發現，隨著海洛因吸食年限的增加，人體外周血中T淋巴的凋亡逐漸增加，細胞的增殖活性逐漸降低，這可能是海洛因在人體T淋巴細胞線粒體水平影響下對細胞生長作用中的宏觀體現。

由此可見，長時間吸食海洛因可造成機體氧化應激狀態超負荷，通過增加自由基的產生，ROS與大分子反應以及之后的持續鏈式反應，使線粒體正常結構和功能發生改變，影響其產能效應，最終導致細胞凋亡增加和（或）細胞增殖減少，從而通過線粒體途徑對T淋巴細胞產生不利影響。

［1］ Zhuang W X，Tatia L，John X Z，et al.Thirsty heroin addicts show different fMRI activations when exposed to water－related and drug－related cues［J］.Drug Alcohol Depend，2006，83：157－162.

［2］ 韋獻良，葉峻.海洛因成癮大白鼠腦神組織超微機構變化的研究［J］.電子顯微學報，2004，23（1）：31－32.

［3］ Yang SH，Chien CM，Lu MC，et al.Cardiotoxin Ⅲinduces apoptosis in K562cells through a mitochondrial－mediated pathway［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2005，32（7）：515－520.

［4］ Mustafa Cemek，Mehmet Emin Büyükokuroglu，Omer Hazman，et al.Sait Bulut＆ Yavuz Osman Birdane The Roles of Melatonin and Vitamin E Plus Selenium in Prevention of Oxidative Stress Induced by Naloxone－Precipitated Withdrawal in Heroin－Addicted Rats［J］.Biol Trace Elem Res，2011，142：55－66.

［5］ 周亮，林敏仕.線粒體呼吸鏈復合物I缺陷與海洛因海綿體狀白質腦病的關系［J］.南方醫科大學學報，2013，33（9）：1357－1361.