貴州地區丙型肝炎患者病毒基因型與外周血輔助性T細胞因子表達相關性研究

梁躍東 楊興林 洪章萍 熊金鳳 黃海

（1.貴陽市第五人民醫院，貴州 貴陽550004；2.貴陽醫學院檢驗系，貴州 貴陽550004）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染后約80%發展為慢性肝炎，約25%發展為肝硬化、肝癌［1］。引起丙肝慢性化的重要原因之一是宿主免疫功能的變化，其中T淋巴細胞及其所分泌的細胞因子的變化顯著影響了感染的進程。因此了解近年來貴州地區 HCV流行株的基因型，了解HCV感染過程中T淋巴細胞及其細胞因子的變化，對臨床治療具有指導意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇貴陽市第五人民醫院2011年10月至2013年7月傳染科門診和住院患者中HCV RNA為陽性的慢性丙肝患者198例，其中男109例，女89例，年齡20～74歲；診斷均符合2004年中華醫學會肝病學分會、中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會《丙型肝炎防治方案》，所有患者的抗－HCV檢測為陽性，且排除其他類型肝炎病毒感染，均未使用過干擾素和其他免疫調節劑。45例健康對照標本來自本院健康體檢人群。

1.2 HCV－RNA定量檢測 采用實時熒光定量（RQ－PCR）法，采用上海科華股份有限公司生產的HCV熒光定量PCR試劑盒檢測，靈敏度為5×102IU／mL。

1.3 HCV基因分型 用異硫氰酸胍（Trizol）－氯仿－異丙醇抽提血清中的HCV RNA，用75%的乙醇洗滌RNA沉淀，15μL DEPC水溶解核酸－70℃保存或立即冰浴備用。依據HCV Core－E1區核苷酸序列合成4條引物，引物由上海生工生物技術有限公司合成。引物序列為：CEI－ESP 5’－GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC－3’，CEI－EAP 5’－CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT－3’，CEI－ISP 5’－AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT－3’，CEI－IAP 5’－GT－TCATCATCATATCCCATGCCAT－3’。逆轉錄及首輪PCR同時進行，逆轉錄反應條件為：42℃40min；94℃15s，60℃15s，72℃30s，共擴增30個循環；72℃延伸5min，得到外擴增PCR產物。取2μL為模板，進行第2輪PCR反應，PCR循環參數與首輪相同，得到內擴增PCR產物，擴增片段為474bp。PCR產物置1.5%的瓊脂糖電泳20min，凝膠成像分析儀觀察結果。取陽性PCR產物，用Promega的PCR DNA純化體系進行純化，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，CEl－ISP作為測序引物。

1.4 細 胞 因 子 檢 測 血 清IL－2、IL－8、IL－10 和TFN－α檢測采用ELISA法，試劑盒購自生物晶美工程有限公司，按試劑盒說明方法進行檢測。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，年齡、血清細胞因子水平數據用t檢驗，以（ˉx±s）表示，性別資料用χ2檢驗，不同基因型細胞因子水平比較用F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 198份丙型肝炎患者HCV基因分型 結果顯示，1a型4例（2.02%），1b 型71例（35.86%），2a型9例（4.55%），3a型29例（14.65%），3b型47例（23.74%），6a 型 37 例 （18.69%），6d 型 1 例（0.50%）。

2.2 慢性丙型肝炎患者血清細胞因子水平與正常對照組的比較 198例慢性丙型肝炎患者血清細胞因子水平與正常對照組比較結果見表1，血清IL－8與正常對照組比較差異無統計學意義，而慢性丙型肝炎患者血清IL－2、IL－10、TNF－α與正常對照組比較差異均有統計學意義。

表1 慢性丙型肝炎患者血清細胞因子水平與正常對照組比較 （pg／mL）

2.3 慢性丙型肝炎患者不同基因型細胞因子水平比較 184例不同基因型之間細胞因子水平的結果比較，發現IL－2與TNF－α在各基因型間比較差異無統計學意義。IL－8在lb型患者血清中含量與3a、3b、6a型患者比較差異有統計學意義（P＜0.05），3a、3b、6a型患者血清中IL－8含量兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）；IL－10在lb型患者血清中含量與3a、3b、6a型患者比較差異有統計學意義（P＜0.05），3a、3b、6a型患者血清中IL－10含量兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。1a、2a、6a檢測例數較少未進行統計比較。見表2。

表2 丙型肝炎患者不同基因型細胞因子水平比較

3 討 論

慢性丙肝感染可導致肝硬化、原發性肝癌，但發病機制尚不明確。近來發現，宿主免疫應答在HCV感染的慢性化中，尤其是Th1／Th2相關因子表達失衡在丙型肝炎發病機制中可能起重要作用［2－3］。細胞毒T淋巴細胞（CTL）是主要的效應細胞，激活的CTL細胞通過釋放穿孔素和Fas介導的細胞凋亡途徑清除病毒，同時導致肝細胞炎癥壞死。CTL細胞需在Th細胞輔佐下才能充分發揮作用。Th細胞即輔助性T淋巴細胞，前體Th0細胞可分化為Th1／Th2兩個優勢亞型，Thl細胞主要分泌IL－2、IL－12、IFN 、TNF等，能促進細胞免疫，對 CTL的功能有輔佐作用；Th2細胞主要分泌IL－4、IL－5、IL－6、IL－10等，對 Th1細胞有抑制作用，它抑制細胞免疫，增強體液免疫，細胞因子水平和Thl／Th2優勢亞群兩者互相影響，互為因果。Thl細胞有利于病毒的清除而Th2細胞主要與組織損傷及慢性化有關。Thl細胞與Th2細胞之間的活性的平衡決定了感染的結局及臨床表現，進而影響HCV感染者的慢性化和臨床轉歸。

本文結果顯示，慢性丙型肝炎與正常對照組比較，丙型肝炎患者體內存在Th1型細胞因子分泌IL－2、TNF－α明顯降低，Th2型細胞因子分泌IL－10增高，可抑制宿主的細胞免疫功能，使機體不能清除病毒，可能是HCV感染慢性化的重要機制，與相關報道［4－5］相符。分析以上研究結果可知，CHC患者體內Th2類細胞因子均呈高表達狀態，Th1類細胞因子表達情況的報道尚不完全一致，可能與收集病例樣本有關。本研究也發現IL－2、TNF－α表達較低的現象，CHC患者Th1類細胞因子表達受到抑制，而Th2類細胞因子高表達，可能Th1類細胞因子水平低下是導致機體細胞免疫功能缺陷、使病毒清除障礙及感染慢性化的原因之一。

目前干擾素－a聯合利巴韋林（RBV）是公認治療慢性丙型肝炎有效的藥物，能有效抑制患者HCV復制，減輕肝臟炎癥壞死和肝纖維化。在治療前評估、療效預測及個體化療程，其中基因型最為重要，目前多數指南推薦基本療程為：基因1型48周，基因2／3型24周［6］。近年來，相關的研究結果顯示，在治療過程中Thl／Th2類相關因子均有不同的變化，賈紅宇等［7］對24例HCV攜帶者和27例CHC患者血清IL－18和IL－10水平的研究發現，CHC患者該兩種細胞因子水平明顯高于正常對照組和HCV攜帶組，27例CHC患者經干擾素－a治療6個月后IL－18和IL－10水平較治療前明顯降低。血清中IL－10水平由高到低依次為：治療無應答組＞部分應答組＞完全應答組。胡敏濤等［8］報道用聚乙二醇干擾素a－2b治療的慢性丙型肝炎患者58例，用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測治療前后患者血清INF－r、IL－2、IL－6、IL－10的變化，治療48周后應答組與無應答組比較，INF－r、IL－2水平均顯著升高，IL－6、IL－10水平則顯著降低，差異均有統計學意義。慢性丙型肝炎患者血清IL－8含量明顯增高，IL－8能降低2’－5寡腺苷合成酶活性，抑制內源性IFN－a的合成，有研究證明，NS5A基因的刺激可使IL－8的合成增加8～12倍，發現非結構蛋白NS3和NS4抗體水平與病毒血癥程度無相關性，高水平病毒血癥患者的抗－NS5抗體顯著增高，說明NS5蛋白是激活HCV復制的重要因子。以上研究結果表明，某些細胞因子，特別是IL－2、IL－10、IL－8、TNF等的水平，可做為CHC預后和預測IFN治療效果的指標。本實驗通過對CHC患者血清IL－2、IL－10、IL－8、TNF－a及基因型檢測，結果顯示在治療前CHC患者1b型中外周血IL－8、IL－10明顯高于3a、3b、6a型，提示1b型患者抗病毒治療效果不佳的因素之一。在基因型與細胞因子的關系報道較少，在不同基因型CHC患者抗病毒治療過程中細胞因子的動態變化正做進一步研究。

總之，丙型肝炎的顯著臨床特點就是極易慢性化，而T淋巴細胞以及細胞因子在HCV感染慢性化中起著重要作用，Thl／Th2相關細胞因子水平不但與丙型肝炎的慢性化和疾病進程有關，而且與IFN療效關系密切。HCV基因型對于肝損傷、疾病進展和轉歸的影響尚有不同觀點，不同基因型與HCV感染后的病情變化以及干擾素的療效有一定相關性。如何能把基因型與相關細胞因子水平的變化在預測丙型肝炎的診斷、治療和預防，規范檢測方法，仍需進一步深入研究。

［1］ Hezode C，Forestier N，Dusheiko G，et al.Telaprevir and peginterferon with or with out ribavirin for chronic HCV infection［J］.N Engl J Med，2009，360（18）：1839－1850.

［2］ 董漪，張鴻飛，陳昊，等.小兒慢性丙型肝炎外周血T細胞亞群和TH1／TH2型細胞因子的研究［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，2007，21（1）：26－28.

［3］ Par G，Berki T，Palinkas L，et al.Immunology of HCV infection：the causes of impaired Cellular immune response and the effect of antiviral treatment［J］.Orv Hetil，2006，147（13）：591－600.

［4］ 牛文強.慢性丙型病毒性肝炎患者血清細胞因子水平檢測及臨床意義［J］.國際檢驗醫學雜志，2012，33（8）：983－984.

［5］ 張穎，謝志宏.慢性丙型肝炎患者外周血Thl／Th2表達失衡的研究［J］.現代實用醫學，2012，24（11）：1274－1276.

［6］ 吳曉寧，彭真，賈繼東.丙型肝炎治療及療效判斷指標進展 ［J］.中 華 檢 驗 醫 學 雜 志，2010，33（11）：1100－1102.

［7］ 賈紅宇，盛吉芳，周林福，等.血清IL－18和IL－10在慢性丙型肝炎發病中作用的臨床研究［J］.中國感染控制雜志，2006，5（4）：303－305.

［8］ 胡敏濤，毛燕群，裴豪，等.聚乙二醇干擾素治療丙型肝炎前后淋巴細胞亞群及輔助性T淋巴細胞因子的變化［J］.中國全科醫學雜志，2011，14（11）：3829－3832.