不同采收期玄參中核苷類成分的含量分析

王勝男 ，華愉教，鄒立思，羅益遠，劉訓紅*，劉娟秀，嚴 穎，徐 力

1南京中醫藥大學，南京 210023;2 揚州市藥品檢驗所，揚州 225000

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根，是一味大宗常用中藥材。具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結的功效［1］。現代研究表明，玄參具有保護心腦血管系統、抗炎、增強免疫等藥理活性［2-4］，其藥效成分除了環烯醚萜類、苯丙素苷類及有機酸類成分之外，核苷類成分對藥效發揮的協同作用也不能忽視［2-5］。近年來研究證實核苷類成分具有廣泛的生理活性，如改善心腦血液循環、防止心律失常、免疫調節、抗病毒、抑制神經遞質釋放等作用［5-9］。玄參滋陰藥效的物質基礎尚不明確，但陰虛患者常表現為免疫功能低下［5］，因此，鑒于核苷免疫調節作用，可以推斷其為玄參滋陰的功效物質基礎之一。

目前，關于玄參藥材的質量評價及采收期考察，多以環烯醚萜類、苯丙素苷類及有機酸類成分為主要指標［10，11］，尚未見核苷類成分的研究報道。本實驗以道地產區浙江磐安玄參為研究對象，基于超高效液相色譜-串聯四級桿/線性離子阱質譜(UPLCQTRAP-MS/MS)技術，建立同時測定玄參中10 種核苷類成分含量的方法，分析不同采收期玄參中核苷類成分積累的動態變化，為深入探討玄參藥材的品質形成機制及確定其藥材適宜采收期提供基礎資料，同時為玄參藥材質量的綜合評價提供新的方法參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津液相UPLC-20ADXR 系列(日本Shimadzu公司)，配有溶劑脫氣裝置、自動進樣器;API 4000四極桿-線性離子阱質譜儀(美國AB SCIEX 公司)，配有離子噴霧接口;KQ-500B 超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz);BSA2245 型電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司);ME36S 型電子分析天平(百萬分之一，德國賽多利斯公司);湘儀H1650-W 高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2 試藥

對照品尿嘧啶(批號100469-200401)、鳥嘌呤(批號140631-200904)、次黃嘌呤(批號140661-200301)、尿苷(批號887-200202)、腺嘌呤(批號110886-200001)、肌苷(批號40669-201104)、腺苷(批號110879-200202)(中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%);鳥苷(批號1001103046)、2'-脫氧鳥苷(批號1000943454)、2'-脫氧腺苷(批號2513C105)(美國Sigma 公司，純度均＞98%)。水為超純水，甲醇為色譜純(德國默克公司)，其余試劑為分析純。

玄參樣品采集自道地產區浙江省磐安縣，采收時間分別為:S1—2014年10月3 日，S2—2014年10月10 日，S3—2014年10月18 日，S4—2014年10月24 日，S5—2014年11月2 日，S6—2014年11月8 日，S7—2014年11月15 日，S8—2014年11月22日，S9—2014年12月5 日，均經南京中醫藥大學劉訓紅教授鑒定為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根，留樣憑證存放于南京中醫藥大學中藥鑒定實驗室。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Atlantis T3(2.1 mm×150 mm，3 μm);流動相:甲醇(A)-5 mmol/L 醋酸銨水溶液(含0.1%冰醋酸，B);梯度洗脫:0～4.5 min，3%～4%A;4.5～8 min，4%～18% A;8～10 min，18% A;10～10.1 min，18%～3% A;10.1～13 min，3% A。柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量2 μL。

2.2 質譜條件

離子源:Turbo V，電離模式:(ESI+);采集方式MRM;離子化溫度(TEM):650 ℃。噴霧電壓:5500 V ;霧化氣(GS1):65 L/min;輔助氣(GS2):65 L/min;氣簾氣(CUR):30 L/min，優化的質譜條件參數見表1。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷、2'-脫氧腺苷對照品適量，加純水配制成質量濃度分別為213.00、168.00、160.00、1011.00、190.00、156.00、1042.00、66.00、414.00、91.50 μg/mL 的對照品儲備液。取各對照品儲備液適量，置10 mL 量瓶中，加水定容，配制成尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷、2'-脫氧腺苷質量濃度分別為21.30、16.80、16.00、101.10、19.00、15.60、104.20、6.60、41.40、9.15 μg/mL 的混合溶液，并按2、5、10、50、100、200 倍逐級稀釋，得到一系列不同濃度的10 種核苷混合對照品溶液，供分析用。

表1 優化的質譜條件參數Table 1 Optimized MS/MS parameters

2.4 供試品溶液制備

取玄參粉末1.0 g(過80 目)，精密稱定，置于25 mL 具塞錐形瓶中，加入10 mL 超純水，室溫下超聲(500 W、40 kHz)提取45 min，提取液12000 rpm離心取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線、檢測限和定量限

精密吸取“2.3”項下不同濃度系列對照品溶液及混合對照品儲備液各2 μL，在“2.1”、“2.2”色譜-質譜條件下測定，以對照品的峰面積(Y)對相應的濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程、相關系數和線性范圍;逐步稀釋各對照品溶液，按信噪比(S/N)約為3 計算檢測限(LOD)，以S/N 約為10 計算定量限(LOQ)，見表2。

表2 10 種核苷標準曲線、檢測限和定量限Table 2 Calibration curves，LODs，and LOQs of 10 nucleosides

圖1 對照品(A)及樣品(B)提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms (EIC)of reference substances (A)and sample (B)

2.5.2 精密度試驗

精密吸取稀釋后的混合對照品溶液，連續進樣6 次，測定各對照品峰面積，所得峰面積的RSD 分別為:尿嘧啶1.9%、鳥嘌呤1.9%、次黃嘌呤1.2%、尿苷2.0%、腺嘌呤1.5%、肌苷2.3%、鳥苷5.7%、2'-脫氧鳥苷4.8%、腺苷2.8%、2'-脫氧腺苷3.8%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗

取S4 號樣品的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，測定尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷和2'-脫氧腺苷的峰面積，所得峰面積的RSD 值分別為1.6%、1.3%、0.8%、2.3%、3.9%、2.8%、2.3%、1.0%、1.8%、2.4%。

2.5.4 重復性試驗

取S4 號樣品粉末各6 份，分別按“2.4”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進樣測定各成分含量，計算相應的RSD。尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷和2'-脫氧腺苷的RSD 分別為2.4%、1.9%、1.4%、1.4%、2.7%、0.5%、3.6%、1.8%、0.7%、1.1%。

2.5.5 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品粉末(S4 號樣品)各6 份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入一定量的尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷和2'-脫氧腺苷對照品，按照供試品溶液制備方法制備加樣回收率供試品溶液，在“2.1”、“2.2”項下的色譜—質譜條件下進行測定，計算回收率。計算得出尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2'-脫氧鳥苷、腺苷和2'-脫氧腺苷的平均回收率分別為3.44%、2.72%、3.36%、3.49%、2.78%、2.84%、4.63%、3.40%、2.67%、1.76%。

2.6 樣品測定

將供試品溶液注入液相色譜/質譜聯用儀，依法測定，根據相應線性關系計算供試樣品中10 種核苷的含量，結果見表3。

表3 不同采收期玄參樣品中10 種核苷的的含量(μg/g，n=2)Table 3 Contents of 10 nucleosides in Scrophulariae Radix samples with different harvesting periods (μg/g，n=2)

3 討論

研究發現，核苷類化學成分對人體免疫、代謝以及肝臟、心血管及神經系統等發揮著重要的生理作用，且具有抗菌和抗病毒等生理活性，尤以腺苷的藥理作用最為明顯，如腺苷具有改善心腦血液循環、防止心律失常、抑制神經遞質釋放和免疫調節等［6］。玄參的滋陰功效在現代藥理學上體現為免疫調節作用。因此，核苷類成分作為玄參藥材質量控制或考察采收期的一項指標具有一定的科學性。

實驗結果表明，玄參藥材中10 種核苷類成分含量差異較大，以鳥苷、尿苷、腺苷、尿嘧啶的含量較高，鳥嘌呤、次黃嘌呤、2'-脫氧鳥苷和2'-脫氧腺苷的含量較低。鳥苷含量的波動較大，主要表現為在10月初其含量較高，隨之呈現遞減趨勢;從10月下旬開始，鳥苷含量又呈現遞增趨勢;在11月份鳥苷含量保持平穩。尿苷和腺苷含量在10月初呈現下降趨勢，從10月中旬開始又呈現上升趨勢，在10月下旬基本保持平穩。尿嘧啶的含量保持平穩狀態。通過不同采收期核苷總量變化折線圖可以得出核苷含量自10月初呈現下降趨勢，從10月中旬呈現上升趨勢，在11月份核苷含量基本保持平穩，在12月初核苷含量稍有下降。不同采收期玄參中核苷類成分含量呈現動態變化，以11月份采收的玄參藥材中主含核苷及核苷總量較為平穩且處在較高水平。綜上結果，從核苷這一指標成分動態變化的角度，支持了玄參藥材產地傳統采收期的合理性，與2015年版《中國藥典》規定的冬季莖葉枯萎時采挖基本一致。至于玄參藥材適宜采收期的確定還需對玄參中的環烯醚萜類、苯丙素苷類、有機酸類成分等多元指標成分以及藥材產量進行綜合考察，仍有待于進一步深入研究。

本實驗建立了UPLC-QTRAP-MS/MS 同時測定玄參中10 種核苷類成分含量的方法，分析了不同采收期玄參中核苷積累的動態變化，從而為深入探討玄參藥材的品質形成機制及確定其藥材適宜采收期提供基礎資料，同時為玄參藥材內在質量的綜合評價和全面控制提供了新的方法參考。

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