山茱萸對腎間質纖維化的保護作用及機制研究

陳 燁，朱春玲，嚴 瑞，劉曉霞，宋文玉

貴州醫科大學附屬醫院腎病風濕科，貴陽 550004

慢性腎臟疾病(CKD)常緩慢發展，往往導致廣泛的腎間質纖維化(RIF)，最終發展為終末期腎衰。腎臟纖維化的病理學特征主要表現為腎小球硬化、腎小管間質纖維化和腎內血管硬化［1，2］。腎小管間質病變程度對10年腎臟存活率具有決定性影響，對腎臟預后的影響較腎小球病變更為嚴重。目前，腎間質纖維化尚無有效的治療方法。因此，尋找有效的能夠干預腎間質纖維化的藥物，從而減輕或逆轉腎間質纖維化，阻止殘余腎功能下降顯得尤為重要和迫切。本研究通過建立SD 大鼠UUO 模型，觀察山茱萸對其腎間質纖維化的影響及其腎組織中YKL-40、β-catenin 等表達的影響，旨在探討腎間質纖維化的作用機制及山茱萸對其的治療作用。

1 材料與儀器

1.1 試驗動物

7 周齡雄性清潔級SD 大鼠36 只，體重200～250 g，由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，生產許可證號:SCXK(渝)2007-0003，使用許可證號:SYXK。

1.2 藥品與試劑

山茱萸(貴州省同濟堂中藥有限公司，批號:120818)。YKL-40(bs-1093R)、β-catenin、SABC 免疫組化試劑盒、DAB 顯色劑均購自北京博奧森生物科技有限公司。細胞總蛋白提取試劑盒購自美國Pierce 公司提供;兔抗小鼠Wnt4 和β-catenin、YKL-40、β-actine 一抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗均由美國Cell Signaling 公司提供;ECL 化學發光液由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3 儀器

組織自動脫水機(型號ZT-12P2)，石蠟包埋機(型號YB-6LF)，石蠟切片機(型號 Leica RM 2235)，電熱恒溫干燥箱(型號202-O)，生物組織攤烤片機(型號YT-7F)，光學顯微鏡(型號OLYMPUS BX51)。

2 實驗方法

2.1 試劑的配制

山茱萸研磨成粉狀，與雙蒸水配成混懸液，按300 mg/Kg/d 灌胃，即配即用。

2.2 動物模型制作及分組

參照文獻方法［3］進行UUO 模型制備，大鼠適應性飼養1 周后，測體重，尿蛋白陰性后，隨機分為假手術組(S 組，12 只)，模型組(U 組，12 只)、山茱萸(300 mg/Kg)干預組(D 組，12 只)，并據造模及藥物干預時間再分為U7天組、U14天組、D7天組、D14天組，同時假手術組相應有S7天組、S14天組相對應。模型組(U 組)和山茱萸干預組(D 組)予10%水合氯醛(2 mL/Kg)腹腔注射麻醉后，無菌手術打開腹腔分離左側輸尿管近腎盂端，用4 號線結扎并剪斷輸尿管，分層縫合關閉腹腔。假手術組(S 組)只分離但不結扎和剪斷輸尿管。各組大鼠均自由飲水及進食。術后第1 d 開始，用藥組(D 組)胃注山茱萸飲片液(300 mg/Kg)，余兩組胃注同等量生理鹽水。

2.3 標本制作及組織病理學觀察

造模后7、14 d 分別處死各組大鼠，取左側腎臟立即置于10%福爾馬林中固定48 h，后再進一步脫水、石蠟包埋、切片(厚度3 μm)等行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察腎組織病理改變。Masson 染色觀察腎間質纖維化程度。免疫組化染色檢測YKL-40、βcatenin 的表達水平。蛋白免疫印記法檢測大鼠腎組織Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表達。

2.4 統計學分析

采用SPSS 13.0 軟件對數據進行統計學分析處理。計量資料用均數±標準差表示。多組間均數比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，組間兩兩比較方差齊者用LSD 法，如方差不齊，采用Tamhane’s T2 法;各項指標之間做Pearson 相關分析。均以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 造模后情況

各組動物存活率均為100%，成功制備UUO 模型，分別于術后7、14 d 取腎，肉眼可觀察到手術側腎臟隨著時間推移逐漸增大，顏色較對側變淺，腎盂腫大明顯，腎皮質部分逐漸變薄，其內充滿尿液，表明成功建立單側輸尿管梗阻模型。

3.2 SD 大鼠腎臟的組織病理學改變

肉眼觀察，S 組大鼠左側腎臟隨著時間推移未發生明顯變化，腎臟大小、形態正常，顏色呈深紅色，表面光滑無顆粒感，與右側腎臟無明顯差異。模型組及干預組大鼠左側腎臟體積較同期S 組及右側腎臟增大，梗阻上段輸尿管擴張明顯，顏色變暗淡，皮髓質變薄。隨著時間的推移，模型組與干預組大鼠梗阻輸尿管擴張越來越嚴重，顏色淡紅，皮髓質明顯變薄，內含較多尿液。HE 染色顯示，S 組各時間點腎小球、腎小管結構正常，腎間質無纖維化、水腫及炎性細胞浸潤。U7組腎小管管腔擴張，腎小管上皮細胞可見較多空泡變性，腎間質輕度纖維化、水腫，可見淋巴細胞、單核細胞浸潤。U14組腎小管呈囊性擴張，部分萎縮壞死，彌漫性上皮細胞空泡變性，與小管基底膜彌漫性分離，腎間質纖維化程度加重，大量單核細胞、淋巴細胞浸潤，可見蛋白尿管型、紅細胞管性。D 組各時間點病變同U 組類似，其程度均較同期U 組減輕，但仍較S 組病變重。與S 組比較，U 組的腎小管間質損傷指數(TDI)顯著升高(P＜0.05);而經山茱萸干預后，D 組TDI 顯著降低，與U 組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖1，表1。

表1 各組大鼠TDI 和TFI 的比較(±S)Table 1 Comparison of TDI and TFI in each group (±S)

表1 各組大鼠TDI 和TFI 的比較(±S)Table 1 Comparison of TDI and TFI in each group (±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group;▲P ＜0.05 vs D7th day group.

3.3 Masson 染色

S 組可見腎小管腎小球形態結構正常，腎間質無纖維陽性染色，各時間點無明顯差異。U7 組腎小管、腎間質可見纖維陽性染色，腎小管輕度節段分離;U14 組較U7 組腎間質纖維陽性染色面積增大，呈束狀、網狀分布，腎小管彌漫性分離，部分腎小管萎縮。D7 組腎間質亦可見纖維陽性染色，面積較U7 組減少。D14 組腎間質可見纖維陽性染色面積，呈束狀、網狀分布，腎小管仍有彌漫性分離，腎小管可見萎縮，但程度較U14 組減輕(見圖2)。與S 組比較，U 組的腎間質纖維化指數(TFI)顯著升高(P＜0.05);而經山茱萸干預后，D 組TFI 顯著降低，與U 組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖2，表1。

圖2 各組大鼠腎組織Masson 染色(×200)Fig.2 Masson staining of renal tissue in each group (×200)

3.4 免疫組化法檢測YKL-40 的表達

S 組腎間質見少量的YKL-40 表達，7、14 d 時兩組表達量差異無統計學意義(P＞0.05);U7組可見YKL-40 在腎小球、腎間質、腎小管上皮細胞胞漿均有陽性表達，其陽性染色部位平均光密度值較S7組升高，U14陽性染色部位平均光密度值較S14組升高，差異有統計學意義(P＜0.05);D 組仍可見腎間質、腎小管上皮細胞漿、腎小球YKL-40 的陽性表達，但較U 組同期各個時間點表達顯著降低(P＜0.05);但D7組YKL-40 的表達仍高于S7組，差異有統計學意義(P＜0.05)，D14組YKL-40 的表達高于S14組，差異有統計學意義(P＜0.05)。(見圖3、表2)。

圖3 各組大鼠腎組織免疫組化之YKL-40 的表達Fig.3 IHC of YKL-40 expression in the renal tissues of rats

表2 免疫組化法測定各組大鼠腎組織YKL-40 和β-catenin 表達(±S)Table 2 Expression of YKL-40 and β-catenin in renal tissues of rats with immunohistochemistry(±S)

表2 免疫組化法測定各組大鼠腎組織YKL-40 和β-catenin 表達(±S)Table 2 Expression of YKL-40 and β-catenin in renal tissues of rats with immunohistochemistry(±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group;▲P ＜0.05 vs D7th day group.

3.5 免疫組化法檢測β-catenin 的表達

β-catenin 在S 組各個時間點大鼠腎間質內均可見少量表達，隨著時間的推移，β-catenin 的表達未見明顯增加，差異無統計學意義(P＞0.05);U 組各個時間點上均可見β-catenin 在腎間質、腎小管上皮細胞上陽性表達，其平均光密度值顯著高于S 組同時間點，差異有統計學意義(P＜0.05);U14平均光密度值高于U7平均光密度值，差異有統計學意義(P＜0.05);D 組各個時間點上可見β-catenin 在腎間質及腎小管上皮細胞上陽性表達，但D14平均光密度值顯著低于D7光密度值，差異有統計學意義(P＜0.05)，且D14光密度值低于U14光密度值，差異有統計學意義(P＜0.05)。(見圖4，表2)。

圖4 各組大鼠腎組織免疫組化之β-catenin 的表達Fig.4 IHC of β-catenin expression in the renal tissues of rats

3.6 蛋白免疫印記法檢測大鼠腎組織Wnt4 和βcatenin、YKL-40 蛋白表達

與S 組比較，U 組Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表達量顯著升高(P＜0.05);而經山茱萸干預后，D 組Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表達量顯著降低，與U 組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖5，表3。

3.7 相關性分析

經相關性分析，TDI 與Wnt4、β-catenin、YKL-40均呈顯著正相關(P＜0.001);TFI 與Wnt4、β-catenin、YKL-40 均呈顯著正相關(P＜0.001);YKL-40與Wnt4、β-catenin 呈顯著正相關(P＜0.001);βcatenin 與Wnt4 呈顯著正相關(P＜0.001)。

表3 各組大鼠腎組織蛋白免疫印記之Wnt4 和β-catenin 蛋白、YKL-40 的表達(±S)Table 3 The expression of Wnt4，β-catenin and YKL-40 protein in renal tissues of rats(±S)

表3 各組大鼠腎組織蛋白免疫印記之Wnt4 和β-catenin 蛋白、YKL-40 的表達(±S)Table 3 The expression of Wnt4，β-catenin and YKL-40 protein in renal tissues of rats(±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group。

圖5 各組大鼠腎組織蛋白免疫印跡之Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白的表達Fig.5 Western blotting of Wnt4，β-catenin and YKL-40 in renal tissue of rats

4 討論

幾丁質酶樣蛋白YKL-40 是一個相對分子量為40000 的肝磷脂和殼質鏈接的凝集素。活化的巨噬細胞、中性粒細胞、血管平滑肌細胞、關節炎患者的軟骨細胞等多種細胞均可分泌YKL-40。體外實驗中，其誘導巨噬細胞及單核細胞成熟，并由后期分化的巨噬細胞和活化的巨噬細胞分泌，與先天免疫系統及胞外基質重塑有關［4，5］。健康人血漿中雖然存在YKL-40，但濃度較為固定，不受生理活動影響。有研究表明，YKL-40 以一種劑量依賴方式刺激組織細胞如成纖維細胞、滑膜細胞及軟骨細胞等人體的連接組織細胞增生，同時還可調節成纖維細胞及滑膜細胞的有絲分裂，在細胞外基質形成和基質重構中發揮重要作用。同時，Wnt/β-catenin 信號途徑在腎臟胚胎發育和腎臟腫瘤的發生中均起著關鍵作用。研究發現，在wnt7b 基因敲除的小鼠急性腎損傷模型中發現腎小管損傷嚴重、上皮細胞再生延遲，提示Wnt7b 可能參與了腎小管上皮細胞損傷后的修復功能［6］。而Wnt 信號通路及其效應器β-cat 被證實在傷口愈合過程中促進纖維增生［7，8］。在UUO大鼠模型中wnt/β-catenin 信號通路異常激活，并參與腎間質纖維化的發生發展。

現代藥理研究已知，山茱萸的果肉含山茱萸環烯醚萜總苷、莫羅忍冬苷、熊果酸、沒食子酸、維生素A 等，具有調節免疫、抗炎抗氧化、降血糖等作用［9］。研究發現，山茱萸環烯醚萜總苷不僅能顯著降低DN 大鼠的尿微量白蛋白，減輕腎臟病理學改變，并可通過抑制氧化應激來保護腎臟組織。體外實驗發現，山茱萸環烯醚萜苷對抗AGEs 對腎小球系膜細胞損傷的機制，可能是通過抑制氧化應激保護腎小球系膜細胞免受AGEs 的損害［10］。

本研究結果顯示，假手術組大鼠腎組織腎小管上皮及間質細胞中即有少量YKL-40 表達，其平均光密度約為0.0193 ±0.0004，隨時間增加表達相對恒定，無明顯變化。目前有研究發現健康人血漿中就存在YKL-40，且濃度較為固定，不受生理活動影響［11］，上述實驗結果與其他學者觀察到的結果一致，說明YKL-40 在正常腎組織中可能起維持特定生理功能的作用。模型組隨時間的增加，腎小管上皮及間質細胞中YKL-40 陽性表達明顯增強，U7天組與U14天組分別與假手術對應組比較差異有統計學意義(P＜0.05，表2～3)，U7天組與U14天組比較差異有統計學意義(P＜0.05，表2～3)。隨著腎間質纖維化的進展，YKL-40 的表達在顯著增強的同時，還與Wnt4、β-Cats 呈顯著正相關關系，因而提示其可能參與了腎間質纖維化發生發展。提示YKL-40 可能是一個內源性的促纖維化細胞因子。

目前對YKL-40 的研究尚不夠深入，其參與的信號轉導通路目前尚未明確。Wnt4 及β-catenin 信號通路是重要的反應腎間質纖維化過程的信號通路。模型組各個時間點上均可見β-catenin 在腎間質、腎小管上皮細胞上陽性表達，其平均光密度值顯著高于同期假手術組(P＜0.05);U14天組平均光密度值高于U7天組(P＜0.05)，同時，與S 組比較，U組Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表達量顯著升高(P＜0.05);而經山茱萸干預后，D 組Wnt4 和βcatenin、YKL-40 蛋白表達量顯著降低，與U 組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)。與免疫組化檢測結果相一致，提示Wnt4 及β-catenin 信號通路參與了腎間質纖維化的發生發展過程，同時還發現，YKL-40 與β-Cats 呈顯著正相關關系(r=0.987，P＜0.001)，提示YKL-40 與該信號通路存在正向聯系的可能性極大，但其具體作用環節及機制，以及在此通路中所處的上下游位置，尚待日后進一步深入研究。

研究結果還顯示，藥物治療組與同期模型組比較，YKL-40、β-catenin 表達均有所下降(P＜0.05)，說明山茱萸治療后，腎間質纖維化有所減輕，推測其對腎臟具有一定的保護作用，其機制可能通過減少Wnt4 及β-catenin 信號通路的激活，下調YKL-40 的激活和釋放來發揮作用。但本研究僅對YKL-40 在腎間質纖維化中的作用做了初步探索，未對其發病的具體信號通路及作用環節進行深入研究，且缺乏YKL-40 敲除老鼠模型的相關數據作為參照，在下一步的研究中擬通過YKL-40 敲除老鼠模型研究YKL-40 在腎間質纖維化中的作用，以及山茱萸作用的具體通路進行進一步深入研究。

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