玉米芯誘導里氏木霉Rut C30 產纖維素酶的分析

馬立娟，蔡 瑞，崔有志，赫榮琳，陳樹林，肖冬光

(1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308)

里氏木霉(Trichoderma reesei)是一種噬溫的腐生真菌，被廣泛應用于纖維素和半纖維素水解酶類的生產和研究中[1].T.reesei 產生的纖維素酶是一類誘導酶類，其合成和表達必須在誘導物的作用下才能進行.已報道的誘導T.reesei 產纖維素酶的物質主要是一些糖類，包括聚糖、寡糖和單糖，其中，以纖維素、槐糖的誘導效果最好，但是，由于槐糖價格昂貴無法作為工業化生產纖維素酶的誘導原料[2–4].作為纖維素酶分解的底物，天然纖維素本身即是良好的誘導劑[5].目前，關于T.reesei 纖維素酶誘導方面的研究大部分針對乳糖和纖維素開展[6–9].對于復合誘導物木質纖維素誘導T.reesei 產纖維素酶的過程分析方面的報道較少.2013 年，Bischof 等[10]比較分析了天然纖維素小麥秸稈和乳糖誘導里氏木霉合成纖維素酶的轉錄組，揭開了天然纖維素誘導T.reesei 合成纖維素酶的分子機理研究的序幕.

本研究以T.reesei 為研究對象，分別比較了不同誘導碳源誘導T.reesei 的產酶水平.以玉米芯為誘導物得到的酶液對玉米芯進行水解，采用高效液相色譜(HPLC)法分析水解過程中糖的組成及變化.最后分析比較水解得到的部分糖對T.reesei 纖維素酶誘導合成的影響.

1 材料與方法

1.1 菌種

里氏木霉(T.reesei)Rut C30 ATCC56765 由中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)購得.

1.2 培養基與培養方法

1.2.1 斜面培養基及培養方法

斜面培養基為PDA 培養基(g/L)：馬鈴薯的煮汁200，葡萄糖20，瓊脂20，115,℃滅菌20,min.將保存菌種接入PDA 培養基，28,℃恒溫培養6,d.

1.2.2 菌絲體培養基及培養方法

菌絲體培養基(g/L)：葡萄糖3，(NH4)2,SO41.4，KH2,PO42，CaCl2·2H2O 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，多聚蛋白胨1，酵母提取物0.5，吐溫80 1,mL/L，微量元素溶液1,mL/L，用pH 4.8 的50,mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液體系配制.微量元素溶液(mg/L)：FeSO4·7H2O 5，MnSO4·H2O 1.6，ZnSO4·7H2O 1.4，CoCl22，115,℃滅菌20,min.

將斜面上培養好的新鮮孢子制備成孢子懸液，接種于裝有50,mL 培養基的250,mL 三角瓶中，孢子的接種量為108,L–1，28,℃、180,r/min 恒溫培養24,h.

1.2.3 誘導培養基及誘導培養方法

誘導培養基(g/L)：(NH4)2SO40.35，KH2PO40.5，CaCl2·2H2O 0.075，MgSO4·7H2O 0.075，吐溫80 0.25,mL/L，微量元素溶液0.25,mL/L，誘導物10(其中，玉米芯粒度為80 目)，用pH 5.0 的50,mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液體系配制.微量元素溶液組成同上.121,℃滅菌20,min.

將上述預培養好的菌絲體過濾，用0.9%的NaCl溶液洗滌2 次后，接種于誘導培養基，接種量(以干質量計)為2.0,mg/mL，26,℃、200,r/min 條件下恒溫培養，并于不同誘導時刻取樣進行酶活測定.

1.3 玉米芯水解

水解所用粗酶液為T.reesei Rut C30 以玉米芯為底物發酵所得.底物玉米芯質量濃度為100,g/L，酶的轉載量為10,FPU/g；水解過程在50,℃、150,r/min的水浴搖床中進行；水解體系為30,mL，0.05,mol/L pH 4.8 檸檬酸鈉緩沖液為緩沖體系，同時添加0.02‰疊氮化鈉抑制雜菌生長.分別于不同水解時刻取樣進行糖組分的測定.

1.4 分析方法

1.4.1 酶活測定

濾紙酶活(filter paper activity，FPA)的測定采用國際理論與應用化學協會(IUPAC)推薦的標準測定方法[11].以葡萄糖作標準曲線，FPA 酶活力單位定義：在pH 4.8、溫度為50,℃的條件下，1,mL 酶液1,min 水解50,mg Waterman No.1 濾紙條(1,cm×6,cm)產生1,μmol 葡萄糖當量的還原糖的酶用量為1個酶活力單位，用FPU/mL 表示.

β–葡萄糖苷酶酶活的測定也采用IUPAC 推薦的標準方法[11]，其酶活力單位定義：在pH 4.8、50,℃條件下，1,mL 酶液1,min 水解1,μmol 纖維二糖產生2,μmol 葡萄糖當量的還原糖的酶用量為1 個酶活力單位，用IU/mL 表示.

木聚糖酶的活力單位定義：在0.05,mol/L pH 5.3檸檬酸鈉緩沖液、溫度為50,℃的條件下，1,mL 酶液1,min 水解木聚糖產生1,μmol 葡萄糖當量的還原糖的酶用量為1 個酶活力單位，用IU/mL 表示.

1.4.2 可溶性蛋白的測定

可溶性蛋白的測定采用Bradford 法[12]，以牛血清蛋白作標準曲線.將誘導上清液稀釋至適當的濃度，取稀釋后的酶液200,μL 加入2,mL Bradford 工作液并振蕩混勻，5～10,min 內于595,nm 處測定吸光度，代入標準曲線，計算蛋白質質量濃度.

1.4.3 玉米芯水解液糖的分析

玉米芯水解液中各種糖的測定采用高效液相色譜分析儀結合示差檢測器進行測定，色譜柱分別為Aminex HPX-87(300,mm×7.8,mm)碳水化合物分析柱和Aminex HPX-42A(300,mm×7.8,mm)碳水化合物分析柱，流動相均為去離子水，流量為0.6,mL/min，柱溫為75,℃.

2 結果與討論

2.1 不同誘導物對T.reesei Rut C30 產酶的影響

2.1.1 對主要木質纖維素降解酶產量的影響

分別比較了木質纖維素類誘導碳源纖維素、玉米芯、麩皮、小麥秸稈、玉米秸稈誘導T.reesei Rut C30的產酶情況.誘導120,h 后，主要木質纖維素降解酶纖維素酶、β–葡萄糖苷酶和木聚糖酶的產量(分別以濾紙酶活、β–葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶活計)見表1.

由表1 可知：在相同的誘導濃度(10,g/L)下，以玉米芯為誘導物時，120,h 后誘導液中纖維素酶、β–葡萄糖苷酶和木聚糖酶的酶活分別達到1.53,FPU/mL、0.61,IU/mL 和72.86,IU/mL，三者的產量均高于其他幾種誘導物.以纖維素為誘導碳源時3 種酶的產量僅次于玉米芯.文獻[7]報道，槐糖是誘導里氏木霉合成纖維素酶最好的碳源，但是，對于不可溶性的誘導碳源，一般認為纖維素是最好的選擇，但都是在誘導濃度較高的時候，與本研究前期的結果一致[13].然而，在低的誘導濃度時，有半纖維素成分的玉米芯卻表現出較好的誘導能力，這在劉超綱等[14]用玉米芯誘導產木聚糖酶的研究中也有類似的結論，這可能與玉米芯的組成成分和結構有關.

2.1.2 對可溶性蛋白產量的影響

不同誘導碳源對T.reesei Rut C30 分泌的可溶性蛋白的影響如圖1 所示.

圖1 不同誘導物對T.reesei Rut C30 分泌蛋白的影響Fig.1 Effects of different inducers on protein secretion with T.reesei Rut C30

由圖1 可知：誘導120,h 后，以玉米芯為誘導碳源時T.reesei Rut C30 分泌到胞外的可溶性蛋白質質量濃度最高，為2.09,g/L；其次為纖維素、小麥秸稈和玉米秸稈；麩皮誘導所產生的分泌蛋白質質量濃度最低.該結果與產酶結果一致.玉米芯、小麥秸稈和玉米秸稈均為含有半纖維素類的木質纖維素原料，由于半纖維素成分可誘導半纖維素酶的表達，因此以該類碳源為誘導物時T.reesei Rut C30 合成的蛋白的種類較以純纖維素為誘導碳源時多.Bischof 等[10]比較分析了不同誘導碳源小麥秸稈和乳糖誘導里氏木霉合成纖維素酶的轉錄組，1,619 個基因在以小麥秸稈為底物時表達，而以乳糖為底物時不表達，這些基因主要編碼木聚糖酶、幾丁質酶和甘露糖苷酶等.同時，由于玉米芯與秸稈類纖維素原料相比較在結構上的疏松性以及其高含量的半纖維素成分，導致以其為碳源時更容易被T.reesei Rut C30 利用分解為可溶性誘導糖進行誘導產酶.

2.2 玉米芯水解過程糖組分及含量分析

經HPLC 檢測玉米芯水解液中的糖，可檢測到的單糖包括：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖；寡糖包括：槐糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖、木二糖、木三糖等.由于標準品原因，該過程中只定量分析了纖維二糖和單糖，結果如圖2所示.

圖2 玉米芯水解過程中單糖和纖維二糖的含量Fig.2 Cotents of monosaccharide and cellobiose during the enzymatic hydrolysis of corn cob

由圖2 可知：葡萄糖和木糖的質量濃度均是隨著水解時間的延長不斷增加直至水解50,h，質量濃度分別達到19.3,g/L 和14.6,g/L.但是，其他幾種單糖如半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖的質量濃度隨水解時間的延長增加不明顯.對于纖維二糖，則是隨著水解時間的延長其質量濃度先上升后下降，這是由于水解生成纖維二糖的同時，其又被β–葡萄糖苷酶水解為葡萄糖.

2.3 玉米芯水解物對T.reesei Rut C30 產纖維素酶的影響

以玉米芯經酶水解后得到的不同組分為誘導物對T.reesei Rut C30 進行誘導產酶，結果如圖3 和圖4 所示.

由于以玉米芯水解物誘導里氏木霉時β–葡萄糖苷酶產量特別小，計算酶活誤差較大，因此這里在β–葡萄糖苷酶酶活測定方法的基礎上，以1,mL 酶液30,min 水解15,μmol 纖維二糖底物所釋放的葡萄糖的質量濃度來表示誘導過程中產生的β–葡萄糖苷酶.單獨以木聚糖、甘露糖和阿拉伯糖為誘導物時，不能直接誘導纖維素酶和β–葡萄糖苷酶的合成.而以低濃度的半乳糖為誘導物時，纖維素酶和β–葡萄糖苷酶均可得到低水平的誘導表達.這與文獻[15]報道“以乳糖為誘導物時添加低水平的半乳糖可以誘導外切酶CBH1 和CBH2 的表達”的結果一致.但是，其誘導合成纖維素酶和β–葡萄糖苷酶的量遠遠低于以纖維素和玉米芯為誘導物時的產量.

圖3 不同誘導物誘導T.reesei Rut C30 產纖維素酶情況Fig.3 Effects of different inducers on cellulase production with T.reesei Rut C30

圖4 不同誘導物誘導T.reesei Rut C30 產β–葡萄糖苷酶的情況Fig.4 Effects of different inducers on β-glucosidase production with T.reesei Rut C30

為了進一步研究玉米芯水解物對T.reesei Rut C30 產酶的影響，將幾種單糖和木聚糖以相同的濃度與1%的纖維素混合作為誘導物進行誘導產酶，結果如圖5 和圖6 所示.添加甘露糖和阿拉伯糖時，纖維素酶和β–葡萄糖苷酶的產量均下降，結合前面的結果可知，甘露糖和阿拉伯糖抑制T.reesei Rut C30 產酶.而添加半乳糖時，纖維素酶產量上升，但β–葡萄糖苷酶的產量下降.添加木聚糖時，60,h 后纖維素酶和β–葡萄糖苷酶的產量高于纖維素誘導.同時，各種誘導物以相同濃度誘導T.reesei Rut C30 時，玉米芯誘導產纖維素酶、β–葡萄糖苷酶和木聚糖酶的水平是最高的.由此結果可以進一步證實，含有半纖維素成分的玉米芯誘導T.reesei Rut C30 產纖維素酶的過程是一個非常復雜的過程，并且其調控過程可能呈復雜的網絡狀.

圖5 添加不同水解物對T.reesei Rut C30 產纖維素酶的影響Fig.5 Effects of different hydrolysate addition on cellulase production with T.reesei Rut C30

圖6 添加不同水解物對T.reesei Rut C30 產β–葡萄糖苷酶的影響Fig.6 Effects of different hydrolysate addition on β-glucosidase production with T.reesei Rut C30

3 結論

比較不同木質纖維素類誘導碳源誘導里氏木霉Rut C30 產酶的情況，結果表明：以玉米芯為誘導碳源誘導120,h 后，纖維素酶、β–葡萄糖苷酶和木聚糖酶的酶活分別為 1.53,FPU/mL、0.61,IU/mL 和72.86,IU/mL.采用HPLC 法分析玉米芯酶解過程中單糖的組成為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖等.誘導產酶實驗表明半乳糖可誘導纖維素酶的合成，甘露糖和阿拉伯糖抑制T.reesei Rut C30 產纖維素酶和β–葡萄糖苷酶.而木聚糖與纖維素混合時有助于誘導產酶.由此可見，玉米芯誘導的實質仍然是其水解后的可溶性寡糖及半乳糖的共同作用，并且該過程是一個非常復雜的過程.因此，需要進一步從酶的基因表達以及轉錄調控因子表達的水平上對其誘導機理進行研究.

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