三峽庫區烏皮香核桃隔膜粗多糖的提取及抗氧化活性

陳 林，汪開拓，王兆丹，吳應梅，張成庭，曲留柱

重慶三峽學院生命科學與工程學院 生物與食品基礎實驗教學中心(市級實驗教學示范中心)，萬州 404100

核桃隔膜中醫又稱分心木(Diaphragma juglandis Fructus)，為帶骨質內果皮的種隔，完整呈類圓形或橢圓形，直徑約2.5 cm。核桃隔膜中藥制品用于腎虛遺精，滑精，遺尿，瀉痢［1-3］。國內外對核桃屬植物［4-7］藥用性研究較多，從核桃仁、青皮、殼枝葉等部位發現抗腫瘤、抗氧化活性成分。新疆醫科大學對新疆地區核桃品種內隔膜研究發現［8］，多糖是核桃隔膜主要有效成分之一。目前對于核桃內隔膜粗多糖未有系統的測定方法，造成資源浪費。

超聲波提取法利用超聲波的空化效應［9，10］，保持體系穩定溫度，使植物活性成分在不被破壞的情況下溶出。響應面分析方法［11，12］(response surface methodology，RSM)可用于確定各種因素及其交互作用在工藝過程中對指標(響應值)的影響，精確的表述因素和響應值之間的關系。本實驗主要以三峽庫區城口烏皮香核桃品種為原料，探索其隔膜粗多糖的提取工藝并進行抗氧化測定，以期對核桃的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃隔膜，選自重慶城口烏皮香品種，經重慶三峽學院生物與食品基礎實驗教學示范中心主任周濃副教授鑒定為胡桃科核桃屬烏皮香核桃的果核內木質隔膜;粉碎機將其打成粉末，過40 目篩;葡萄糖標準品(色譜純)，上海楚定分析儀器有限公司;其他試劑為常規試劑。

1.2 儀器與設備

JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;FZ102 微型植物粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;ZXFD-A5250 型電熱恒溫培養箱，上海恒科學儀器有限公司;AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;5417R 冷凍離心機，德國eppendorf 公司;HH-4 數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司;RE-52 型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-95B 型循環水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司;UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線

準確稱取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖50 mg 于500 mL 容量瓶中配成0.1 mg/mL 的標準溶液，分別精密吸取標準對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于帶塞試管中，然后依次精密加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL 蒸餾水，在標準液中分別加入5%苯酚溶液1 mL，并迅速加入濃硫酸5 mL，靜置10 min。搖勻，30 ℃條件下放置30 min 后于490 nm 測定吸光值，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作標準曲線。

1.3.2 隔膜粗多糖提取

稱取核桃隔膜2.0 g，適當粉碎，室溫浸泡過夜，加去離子水40 mL，然后濾取提取液，離心提取液(8000 rpm，15 min)，上清液即為隔膜多糖粗提液。在多糖粗提液中加入3 倍90%乙醇沉淀隔膜多糖，然后將所得的沉淀重新用蒸餾水溶解、定容、備用。吸取1.0 mL 樣品溶液，按照上述步驟測出在490 nm 處的吸收值，并代入標準曲線中算出樣品的多糖含量，平行測定3 次。

1.3.3 單因素試驗

在料液比為1∶40(m∶V)，超聲功率105 W，超聲溫度60 ℃下研究超聲波處理時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0 min 對隔膜多糖提取率的影響;在料液比為1∶40(m∶V)，超聲功率105 W，超聲提取時間為30 min 下研究超聲波處理功率分別為100、200、300、400 W 對隔膜多糖提取率的影響;在超聲溫度60 ℃，超聲功率105 W，超聲提取時間為30 min 下研究超聲波處理料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(m∶V)對隔膜多糖提取率的影響。

1.3.4 響應面方法的確定

在單因素試驗的基礎上分別以提取功率、提取時間及料液比3 個因素為考察對象(表1)，以粗多糖提取率為響應值，利用SAS9.2 統計軟件分析進行提取條件的優化。

表1 分心木粗多糖提取響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite test on extraction of crude polysaccharide

1.3.5 隔膜對DPPH 自由基清除作用

準確量取3.9 mL 25.61 mg/L 的DPPH 溶液，加入0.1 mL 體積分數70%的乙醇溶液，混勻，在517 nm 波長處測吸光度(Ac)。將各待測樣品用相應的提取溶劑配成10、20、40、80、160 μg/mL 分別準確量取0.1 mL 不同濃度的各樣品溶液，加入3.9 mL DPPH 溶液(25.61 mg/L)，混合均勻，室溫避光反應30 min 后于517 nm 處測定吸光度(Ai)。同時測定3.9 mL 體積分數70%乙醇溶液中加入0.1 mL不同濃度樣品溶液的吸光度(Aj)［13］，以BHT 作為陽性對照。DPPH 清除率按以下公式計算:

式中:Ai為樣品DPPH 溶液的吸光度;Aj為樣品乙醇溶液的吸光度;AC為空白對照的吸光度。

1.3.6 隔膜對ABTS+自由基清除作用

取5 mL 7 mmol/L 的ABTS+溶液，加入88.0 μL 140 mmol/L 的過硫酸鉀在室溫下置于暗處反應12～16 h 形成ABTS+自由基儲備液。在734 nm處，用體積分數70%的乙醇將ABTS+自由基儲備液稀釋至吸光度為0.70 ±0.02 備用。準確量取0.1 mL 濃度10、20、40、80、160 μg/mL 的樣品溶液，加入3.9 mL ABTS+溶液，混勻，在室溫下反應6 min后734 nm 出測定吸光度AE［14-16］。同時吸取3.9 mL ABTS+溶液，加入0.1 mL 體積分數70%的乙醇溶液于734 nm 處測定吸光度AB。ABTS+自由基清除率計算公式如下:

式中:AB為樣品ABTS+溶液的吸光度;AE為空白對照的吸光度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的測定

將配制好的不同濃度葡萄糖標準品對照溶液在490 nm 波長處測定吸光度A，得到回歸方程Y=12.92X+0.013，R=0.9998。表明葡萄糖濃度在0.0050～0.0135 mg/mL 范圍內線性良好。

2.2 回收率實驗

將一定量的葡萄糖標準品放入已知多糖含量的隔膜中，由表2 可見，回收率實驗符合定量分析要求。

表2 葡萄糖含量回收率實驗Table 2 Recovery experimental results

2.3 隔膜粗多糖提取的單因素實驗

圖1 不同提取時間(A)、功率(B)及料液比(C)對提取率的影響Fig.1 Effects of extraction time (A)，extraction power (B)and solid-to-liquid ratio (C)on the extraction rate of polysaccharide

圖1 為不同提取功率、提取時間及料液比下隔膜粗多糖的提取率。總的來說，提高超聲波功率會得到較高提取率。但功率超過300 W 時，高強度會破壞粗多糖結構，影響提取率。當提取時間超過1.5 min，粗多糖溶解度達到飽和狀態，粗多糖提取率反而逐漸下降。隨著超聲時間延長，植物細胞被破壞，內溶物流出影響粗多糖提取率，故提取時間為1.5 min。超聲功率300 W，提取時間1.5 min 的條件下，料液比從1 ∶10 提高到1 ∶20 時，提取率從2.73%增加到3.25%，進一步提高料液比，提取率下降。

2.4 響應面實驗

根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，確定中心組后試驗的因素和方法，以粗多糖得率為響應值。超聲波輔助提取隔膜粗多糖的響應面試驗的3 因素5 水平進行優化試驗設計與結果(表3)對試驗數據進行回歸分析，回歸模型的方程為:

表3 隔膜粗多糖提取響應面試驗設計方案及結果Table 3 Experimental design and result of central composite test on extraction of polysaccharide

對該響應面回歸模型進行方差分析(表4)。從此模型的方差分析表可知，響應面回歸模型達到顯著水平(P=0.0352＜0.05)，復相關系數R2為0.7158，說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結果，試驗誤差小。

表4 回歸方程的方差分析表Table 4 Analysis of variance of the regression model

從二次多項式回歸模型系數的顯著性檢驗結果(表5)可知，在所選的各因素水平范圍內，對烏皮香核桃隔膜粗多糖提取影響因素大小順序為:提取時間＞提取功率＞料液比。由顯著性檢驗可知X2、X1X3對核桃隔膜粗多糖提取率極顯著(P＜0.01)，X1、X3、X1X2、X2X2、X2X3的影響顯著(P＜0.05)，X1X1、X3X3不顯著。

根據回歸方程做出響應面圖(圖2)。圖2 可直觀反映各因素對響應值的影響。超聲功率、時間及料液比的交互作用對隔膜粗多糖提取均有一定影響，其中以X1 和X3 之間的交互影響明顯，表現為曲面較陡。X1 和X2、X2 和X3 交互影響不顯著。

表5 二次多項式回歸模型系數的顯著性檢驗結果Table 5 Regression coefficients of predicted quadratic polynomial model

圖2 因素交互作用對隔膜粗多糖提取率影響的響應曲面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of different factors on the extraction yield of polysaccharide

由SAS 分析得到響應值Y 最大估計值為26.94 mg/g，此 時X1、X2、X3對應的編碼值分別為0.076778、-0.053771、-0.380417，實際值為超聲功率:312.9 W，提取時間為1.45 min，料液比為1∶23.61。為了實際操作方便選擇超聲功率310 W，提取時間為87 s，料液比為1∶24 g/mL 對核桃隔膜粗多糖提取進行驗證試驗。3 次平行試驗得到的實際皂苷提取率為24.88 mg/g，與預測值非常接近，相對誤差7.65%。因此利用響應面發優化隔膜粗多糖提取條件是可行的。

2.5 烏皮核桃隔膜粗多糖抗氧化性分析

烏皮香核桃隔膜粗多糖的抗氧化活性實驗結果如表6 所示。從表6 可以看出，以BHT 為陽性對照［17］，隔膜皂苷對DPPH 自由基和ABTS+自由基均有清除能力［18］，并隨著質量濃度的增加而加強，呈一定線性關系，R2分別為0.9325 和0.9655，其EC50分別為1.19 mg/mL 和1.21 mg/mL。

表6 烏皮香核桃隔膜粗多糖清除DPPH、ABTS +自由基能力Table 6 Antioxidant effect and scavenging capacity against DPPH and ABTS + of Wu walnut polysaccharide

3 結論

核桃隔膜為民間用藥，許多地區用隔膜代茶飲用有固腎澀精的療效，但其藥用價值沒有得到足夠的重視。研究發現，隔膜含多種活性成分［19，20］，但目前沒有系統的提取方法和藥理活性鑒定。根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上采用了3 因素5 水平的響應面分析方法對烏皮香核桃隔膜粗多糖的提取工藝進行了優化。結果顯示隔膜粗多糖提取的最佳提取工藝條件為∶超聲功率310 W，提取時間為87 s，料液比為1∶24 g/mL。在此條件下測得實際提取率為24.88 mg/g 與預測值的相對誤差為7.65%。同時得到了隔膜粗多糖提取率與各因素變量的二次多項式回歸方程，該模型回歸顯著，實驗擬合較好，具有實際應用價值。抗氧化活性實驗表明隔膜粗多糖對自由基清除效果明顯，有較強的抗氧化活性。本研究對開發庫區資源烏皮香核桃農副產品加工利用提供一定的研究基礎。

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