開菲爾乳飲料益生功能及生產研究進展

陸 娟，唐 俊，屈長青，2*

1阜陽師范學院生物與食品工程學院;2 抗衰老中草藥安徽省工程技術研究中心，阜陽 236037

開菲爾(Kefir)是一種味酸、粘稠的乳酒飲料，由包裹于“開菲爾?！?Kefir Grain)中的細菌和酵母菌發酵羊乳或牛乳而來［1］。開菲爾粒呈無規則的花椰菜狀、珊瑚狀或爆米花狀，白色或淡黃色，大小不等，直徑在0.3～3 cm 之間。相傳，開菲爾起源于1000 年以前的中亞高加索地區，但蛋白質組學證據證明開菲爾最早起源于3800 年前青銅器時代早期的中國新疆［2］。目前，開菲爾已廣泛分布于世界各地，如波蘭［3］、中國［4］、巴西［5］、伊朗［6，7］、土耳其［8］、葡萄牙［9］等地。開菲爾除了具有一般酸奶所沒有的口感和風味外，還具有抗病原菌、抗毒素、免疫調節、抗腫瘤等多種益生功能。本文對開菲爾粒的結構及生長機制、開菲爾的益生功能、應用和生產等方面進行了綜述。

1 開菲爾粒的結構及生長機制

開菲爾粒以非溶解性的蛋白和多糖為基質，其中共生有約30 種乳酸菌［乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)和明串株菌(Leuconostoc)等］和酵母菌［酵母(Saccharomyces)、克魯維酵母菌(Kluyveromyces)、念珠菌(Candida)、假絲酵母(Mycotorula)、有孢圓酵母(Torulaspora)、隱球菌(Cryptococcus)和畢赤酵母(Pichia)等］［3］。開菲爾粒的菌相組成已經比較清楚，但乳酸菌和酵母菌的分布仍存爭議。利用電鏡掃描技術，Bottazzi 等發現乳桿菌主要存在于開菲爾粒的外部，酵母菌存在于開菲爾粒的中間，在乳酸菌大量存在的區域幾乎沒有酵母菌，酵母菌大量存在的區域幾乎不存在細菌［10，11］;而Magalhaes 等發現酵母菌和乳酸菌以一定的比例分布于開菲爾粒中［12］;Leite 等卻發現，桿狀菌存在于開菲爾粒的內部和外部，酵母菌則主要存在于外部［13］。

作為發酵劑，開菲爾粒起初呈薄片狀，一面平而光滑，一面卷曲而粗糙，成熟以后則呈卷軸或牛腸卷狀。Marshall 等研究發現，在光滑面和粗糙面中間的多糖區域存在大量長而彎曲的細菌，它們可能就是開菲爾粒基質多糖產生菌［11］。結構表明，片狀開菲爾粒的生長經歷了彎曲、折疊、再折疊成為卷軸狀過程。因此，粘附在粗糙面的酵母菌在經過折疊后大量存在于開菲爾粒的中間［11］。

Wang 等進一步提出了開菲爾粒折疊的可能機理［14］。開菲爾粒中大部分的乳酸菌是親水性的，細胞表面存在有負電荷。在開菲爾粒的生長過程中，首先，具有自我聚集能力的開菲爾基質乳桿菌(Lactobacillus kefiranofaciens)HL1 和圖列茨酵母(Saccharomyces turicensis)進行自我聚集形成小顆粒;然后，具有生物膜形成功能的開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefiri)粘附于小顆粒的表面，并和奶中其它微生物和成分共聚集形成開菲爾粒;最后，更多的微生物粘附于顆粒物上，開菲爾粒慢慢長大。Xie 等也證明了:開菲爾粒中細菌細胞壁表面的蛋白質和酵母菌細胞壁多糖在共聚集和微生物吸附中起著非常重要的作用，其中酵母菌與提高聚集能力、吸附能力和在不良環境中生存能力等密切相關［4］。

2 開菲爾的益生功能

開菲爾中的多種組成菌都是益生菌，如嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，因此開菲爾具有較好的益生功能。

開菲爾具有抗病原菌、促益生菌作用。2014年，Carasi 等發現來源于開菲爾的6 株開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefiri)CIDCA 8321、CIDCA 8345、CIDCA 8348、CIDCA 83115、CIDCA 83111、CIDCA 83113 對蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)都有抑制作用，但對大腸桿菌(Escherichia coli)都不具有抑制作用;陽性病原細菌和陰性病原細菌對6 株菌都敏感，并且陽性病原菌的敏感性比陰性病原菌強［15］。開菲爾不僅具有抗陽性病原細菌、陰性病原細菌的作用，還具有抗真菌的作用。2011 年，Ismaiel 等發現與中性化的開菲爾懸浮液和純化的開菲爾多糖(0.35 mg/mL、0.70 mg/mL)相比，發酵24 h 的開菲爾懸浮液對糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)KR6 和禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)CZ1 的抗性最高，抑菌圈直徑都達到15.0 mm;當黃曲霉(Aspergillus flavus)AH3 在添加有發酵開菲爾濾出液(7%～10%，v/v)的肉湯培養基中培養10 d 時，其孢子化被完全抑制;并且高濃度(10%)發酵開菲爾濾出液可以完全抑制黃曲霉的菌絲體生長［16］。2014 年，Londero 等發現:24 h 后100 g/L 開菲爾發酵乳清對黃曲霉、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮殼青霉(Penicillium crustosum)、長梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、根霉(Rhizopus)等多種真菌都具有抗性，對它們分生孢子發生的抑制率高達70%以上;并且，家禽飼料在添加發酵乳清(1 L/kg)后可以提高其抗真菌感染能力2～4 倍［17］。另外，開菲爾也具有促進益生菌生長的作用。2014 年，Serafini 等發現，開菲爾或開菲爾多糖可以促進雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)PRL2010 生長，增加雙歧雙歧桿菌中與食用多糖代謝有關酶基因的轉錄;并且，雙歧雙歧桿菌可以進入開菲爾多糖基質中，增加開菲爾粒的菌相組成［18］。

開菲爾具有抗毒素功能。2011 年，Ismaiel 等發現高濃度(10%)發酵開菲爾濾出液可以完全抑制黃曲霉AH3 產生黃曲霉毒素B1［16］。2013 年，Bolla等發現:來源于開菲爾的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)亞種CIDCA 8221 可以產生一種分子量超過10 kDa 的物質，這種物質可以通過體外抑制來源于艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)的細胞毒素TcdA 和TcdB 導致的細胞毒效應而保護真核Vero細胞，但是它在100 °C 處理15 min 后失去該功效［19］。同年，Kakisu 等研究發現:來源于開菲爾的胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CIDCA 83114可以降低大腸桿菌O157:H7 69160 菌株產生的Ⅱ類志賀毒素(Stx2)的細胞毒性而保護Vero 細胞;胚芽乳桿菌的細胞壁也具有該功效，但經熱或蛋白酶處理后失去該功能，因此，他們推斷胚芽乳桿菌的細胞壁存在一種蛋白或肽類與保護機理有關，并且得出胚芽乳桿菌的細胞壁通過與志賀毒素B 亞基結合而降低該毒素的毒性［20］。

開菲爾具有免疫調節活性。2005 年，Vinderola等發現開菲爾可以增加小鼠小腸和支氣管粘膜上IgA+細胞的數量［21］。2010 年，Romanin 等發現來源于開菲爾的酵母菌比乳桿菌能更好的調節腸上皮先天的免疫反應［22］。2014 年，屈長青等也發現1%和5%劑量的藏靈菇乳清都具有提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率的作用［23］。

開菲爾也具有降膽固醇活性。2013 年，Zheng等發現將添加有藏靈菇源嗜酸乳桿菌LA15 的高膽固醇食物飼喂Sprague-Dawley 大鼠4 周，大鼠血清中的總膽固醇、甘油三酸酯和低密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低(P＜0.05)，而排泄物中的膽固醇水平卻明顯升高(P＜0.05)［24］。同年，Huang 等將藏靈菇源的胚芽乳桿菌Lp27 飼喂高膽固醇血癥大鼠4 周，大鼠血清中的總膽固醇、甘油三酸酯和低密度脂蛋白膽固醇水平降低，并且大鼠肝臟中的總膽固醇、甘油三酸酯也得到了降低［25］。

開菲爾還具有抗腫瘤活性。2011 年，Maalouf等發現不含有細菌部分的開菲爾通過上調TGF-β1和下調TGF-α 可有效抑制惡性T 淋巴細胞增殖并誘導其凋亡［26］。2012 年，Gao 等發現不含細菌的藏靈菇通過上調bax(凋亡啟動子)、下調bcl-2(凋亡抑制子)發揮體外誘導胃癌細胞凋亡的作用［27］。2014年，Ghoneum 等發現一種新的開菲爾粒產物(PFT，主要含有開菲爾乳桿菌P-IF 菌株)，該PFT 以一種穿洞模式劑量依賴性的體外誘導骨髓白血病細胞(HL60/AR)凋亡，當濃度為5 mg/mL 時細胞凋亡率達到最高，為67.5%［28］。

開菲爾還可以緩解乳糖不耐受性疾病癥狀。乳糖不耐受性疾病是由于患者的小腸中缺乏β-半乳糖苷酶，不能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，患者在吸食乳糖后產生腹脹、腹瀉、惡心等癥狀。和其他發酵乳一樣，發酵后開菲爾中的乳糖濃度降低，而且由于開菲爾中某些具有β-半乳糖苷酶活性的菌在被飲用后可能存活于小腸中，通過細胞裂解釋放β-半乳糖苷酶而消化半乳糖，或通過改變細胞膜通透性而使乳糖能輕易進入細胞，因而乳糖不耐受性疾病癥狀得到緩解［29］。

不同來源的開菲爾益生功能不一，目前我們課題組研究發現藏靈菇乳清具有免疫調節活性［23］，下一步計劃深入研究其它益生功能，分離純化乳清蛋白，開發相應產品，推進產學研合作。

3 開菲爾的應用

3.1 醫藥方面

開菲爾及其多糖不僅具有抗病原菌、抗毒素、免疫調節、抗腫瘤等多種益生功能，在臨床上，開菲爾還可以有效治療接種有金黃色葡萄球菌的傷口，并且成疤效果比新霉素氯睪酮陽性對照好［30］;在治療燒傷時，開菲爾也比陽性對照磺胺嘧啶能更好的使燒傷處形成上皮、結疤［31］。因此開菲爾在醫藥方面具有巨大的應用潛能。

3.2 食品方面

開菲爾可以廣泛應用于食品工業。一般地，食品在工業應用前要經過嚴格的毒理測試和市場調查，而開菲爾及其相關產物因乳酸菌本身具有安全性而備受工業生產者的青睞［32］。開菲爾多糖具有提高酸化牛奶的流變性功能，可以作為食品級生物活性添加劑使用［33］;它還具有冰點膠化入口即化的特性，因此在膠狀食品中也具有強大的市場魅力［33，34］。此外，開菲爾多糖具有抗菌、免疫調節等活性，可以作為功能食品添加劑使用［33］。在乳酪制造業，以開菲爾為發酵劑可以增加奶酪的結構、風味和延長上架時間;可以延長上架時間，這對身負利用天然產物代替化學防腐劑重壓的生產者來說絕對是一個利好的消息［35，36］。作為食品外包裝的材料，開菲爾多糖以甘油為增塑劑制成的膜因具有阻止濕氣、氧氣、脂類、香味轉移功能而防止食品變質、延長食品上架時間［37］;除此以外，開菲爾多糖制成可食用并可生物降解的膜與以石油衍生物為材料制成的膜相比，前者更易于被有健康意識和環保意識的當代人接受［38］。另外，在烘焙面包時，以開菲爾粒作為酵母比以野生菌作為酵母烘焙出的面包具有更長的保鮮期，保鮮期被延長1 倍，這與面包中乳酸濃度和乙酸濃度大幅增加有關［39］。

4 開菲爾的生產

4.1 開菲爾的生產方法

開菲爾的生產有傳統方法與現代方法之分(圖1)。傳統的開菲爾生產是人工將不定量的開菲爾粒接種到巴氏滅菌或未滅菌牛奶(25 ℃)中，20～25℃發酵18～24 h，過濾除去開菲爾粒得到過濾液，將過濾液4 ℃冷藏成熟即為開菲爾乳飲料。而現代的開菲爾生產主要包括兩個步驟，第一步是制備母發酵劑，類似于傳統方法;第二步是將母發酵劑按1%～3%接種巴氏滅菌牛奶，發酵，冷藏成熟。

受開菲爾粒中的菌相組成和開菲爾的加工過程的影響，傳統的開菲爾生產因開菲爾?；厥者^程繁瑣、發酵不均一、生產不具有一致性而不適于大規模生產，因此，把開菲爾粒中的某些菌株純化培養再混合發酵的現代生產方法成為廣大研究者們開發開菲爾商品的一個關注熱點。目前，開菲爾的工業化生產不是直接以過濾得到的開菲爾粒作為母發酵劑，而是從開菲爾粒中分離得到純培養物或購買商品式純培養物制備母發酵劑，不再需要過濾回收開菲爾粒［40］，節省了大量的人力、物力和財力。Chen 等將細菌和酵母菌按照開菲爾粒中的分布比例分別制成細菌微球和酵母菌微球，這兩種微球可以作為發酵劑進行開菲爾發酵，并且可以循環利用28 個周期［41］。Nambou 等將不同來源的6 株菌馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)BD01004、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbruekii ssp.bulgaricus)BD00014、開菲爾乳桿菌BD00002、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)BD00089、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)BD00736 和腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD01701 進行純化培養，然后按照不同的濃度接入復配脫脂乳(10%，w/w)進行發酵，可以得到與傳統基本相同的開菲爾乳飲料［42］。

圖1 Kefir 乳飲料的兩種生產工藝Fig.1 Two processes of kefir production

4.2 開菲爾生產的影響因素

目前，在研究影響開菲爾生產的因素時大都考慮它們對開菲爾粒中生物量的影響。在開菲爾生產中，多種因素如碳源、氮源、培養溫度、接種量、無機鹽和培養時間等都可以影響開菲爾粒中的生物量［6，8，43-46］(表1)。Gao 等發現在最優條件(脫脂乳41.6%、發酵溫度30.05 ℃、接種量1.86%、轉速0 rpm、發酵時間20 h)下，藏靈菇生長率為14.33%，比未優化前增加了39.4%［43］。而Ghasemlou 等卻發現當最優條件為乳清乳糖88.4 g/L、酵母粉21.3 g/L、pH 5.2、發酵溫度20 ℃時，伊朗開菲爾粒中的生物量可以增加81.34%［6］。在土耳其開菲爾粒接入牛奶(脂肪含量為0.1%)、25 ℃、100 rpm 培養24 h 的過程中，三種礦物質CuSO4·H2O、MnSO4·H2O和Na3PO4·12H2O(Cu2+、Mn2+和PO3?4濃度都為0.30 g/L)中除CuSO4·H2O 外后兩者都可以增加開菲爾粒中的生物量，但維生素B1、B6、B9、B12 和維生素C 卻抑制開菲爾粒中生物量的增加［8］。

另外，添加蜂蜜［47］、酪蛋白酸［48］等物質或改變培養溫度［48］都可以改變開菲爾的流變性。

表1 影響開菲爾粒中生物量的因素Table 1 Factors effect on biomass increase in kefir grain

4.3 開菲爾混合飲料的開發

開菲爾混合飲料的開發研究也得到了廣泛的關注。在奶或乳清中添加水果或其他原料(如石榴［7］、蜂蜜［47］、燕麥［49］、麥芽［50］)一起進行發酵，可以得到口味不同的混合乳飲料。2014 年Sabokbar等發現:把石榴汁與乳清混合作為原料接入伊朗開菲爾粒可以生產新型的開菲爾果汁乳飲料，飲料的pH 降低、酸度增加、產生乳酸和乙酸、檸檬酸水平降低，并且這些變化與培養溫度(19 ℃或25 ℃)和接種量(5%或8%，m/v)密切相關，當培養溫度為25℃、接種量為8%時變化最大［7］。

5 展望

開菲爾具有抗病原菌促益生菌、抗毒素、免疫調節、降膽固醇、抗腫瘤和緩解乳糖不耐受性疾病癥狀等益生功能，在醫藥方面和食品工業具有巨大的應用潛能，體現出巨大的潛在市場價值。傳統開菲爾乳飲料的生產主要受不同來源開菲爾粒的菌相組成和加工條件的影響，使其因開菲爾粒回收過程繁瑣、發酵不均一、生產不一致而不適于大規模生產;目前商品化的開菲爾乳飲料生產主要利用從開菲爾粒中分離純化的純培養物進行工業發酵而來。但是，在功效上工業化生產的開菲爾與傳統小規模生產相比都不太成功，可能開菲爾的益生功能、治療特性與開菲爾粒中微生物的多樣性、它們的互作有關或者與不同開菲爾粒來源的少量特定菌群有關［51］。目前奶片深受消費者的喜愛，而藏靈菇益生菌奶片也有研究報道［52］。因此，大規模工業化生產具有傳統功效的開菲爾乳飲料、增加開菲爾產品類型已經成為開發開菲爾乳飲料的趨勢，這需要加強研究，準確分離開菲爾粒中有益微生物，確定它們的互作性，這些研究成果必將推動傳統功效開菲爾乳飲料大規模工業化生產，進而使開菲爾的應用價值得到更大程度的開發和體現。

1 Garrote GL，et al.Chemical and microbiological characteristization of kefir grains.J Dairy Res，2001，68:639-652.

2 Yang Y，et al.Proteomics evidence for kefir dairy in early bronze age China.J Archaeol Sci，2014，45:178-186.

3 Kolakowski P，et al.Restoration of kefir grains subjected to different treatments.Int J Dairy Technol，2012，65:140-145.

4 Xie N，et al.Kefir yeasts enhance probiotic potentials of Lactobacillus paracasei H9:the positive effects of coaggregation between the two strains.Food Res Int，2012，45:394-401.

5 Leite A，et al.Microbiological and chemical characterization of Brazilian kefir during fermentation and storage processes.J Dairy Sci，2013，96:4149-4159.

6 Ghasemlou M，et al.Enhanced production of Iranian kefir grain biomass by optimization and empirical modeling of fermentation conditions using response surface methodology.Food Bioproc Technol，2012，5:3230-3235.

7 Sabokbar N，et al.Characterization of pomegranate juice and whey based novel beverage fermented by kefir grains.J Food Sci Technol，2014，14:12-19.

8 Demirhan E，et al.Influence of vitamin (B1，B6，B9，B12，C)and ions (Cu2+，Mn2+，PO3-4)on kefir grain biomass growth.Food Sci Biotechnol，2013，22:1007-1013.

9 Santos A，et al.The antimicrobial properties of different strains of Lactobacillus spp.isolated from kefir.Syst Appl Microbiol，2003，26:434-437.

10 Bottazzi V，et al.A note on scanning electron microscopy of micro-organisms associated with the kefir granule.J Appl Bacteriol，1980，48:265-268.

11 Marshall VM，et al.Observations on the structure of kefir grains and the distribution of the microflora.J Appl Bacteriol，1984，57:491-497.

12 Magalhaes KT，et al.Brazilian Kefir:structure，microbial communities and chemical composition.Braz J Microbiol，2011，42:693-702.

13 Leite AMO，et al.Microbiological，technological and therapeutic properties of kefir:a natural probiotic beverage.Braz J Microbiol，2013，44:341-344.

14 Wang SY，et al.Investigation of microorganisms involved in biosynthesis of the kefir grain.Food Microbiol，2012，32:274-285.

15 Carasi P，et al.Safety characterization and antimicrobial properties of kefir-isolated Lactobacillus kefiri.Biomed Res Int，2014，2014:208974.

16 Ismaiel AA，et al.Milk kefir:ultrastructure，antimicrobial activity and efficacy on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus.Curr Microbiol，2011，62:1602-1609.

17 Londero A，et al.Fermented whey as poultry feed additive to prevent fungal contamination.J Sci Food Agric，2014，94:3189-3194.

18 Serafini F，et al.Kefir fermented milk and kefiran promote growth of Bifidobacterium bifidum PRL2010 and modulate its gene expression.Int J Food Microbiol，2014，178:50-59.

19 Bolla PAI，et al.Kefir-isolated Lactococcus lactis subsp.lactis inhibits the cytotoxic effect of Clostridium difficile in vitro.J Dairy Res，2013，80:96-102.

20 Kakisu E，et al.Lactobacillus plantarum isolated from kefir protects vero cells from cytotoxicity by type-II shiga toxin from Escherichia coli O157:H7.J Dairy Res，2013，80:64-71.

21 Vinderola CG，et al.Immunomodulating capacity of kefir.J Dairy Res，2005，72:195-202.

22 Romanin D，et al.Down-regulation of intestinal epithelial innate response by probiotic yeasts isolated from kefir.Int J Food Microbiol，2010，140:102-108.

23 Qu CQ (屈長青)，et al.Antioxidant and immunological activity of whey isolated from Tibetan kefir milk.Nat Prod Res Dev (天然產物研究與開發)，2014，26:1117-1119.

24 Zheng YC，et al.Probiotic properties of Lactobacillus strains isolated from Tibetan kefir grains.Plos one，2013，8:e69868.

25 Huang Y，et al.Characterization of Lactobacillus plantarum Lp27 isolated from Tibetan kefir grains a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects.J Dairy Sci，2013，96:2816-2825.

26 Maalouf K，et al.Kefir induces cell-cycle arrest and apoptosis in HTLV-1-negative malignant T-lymphocytes.Cancer Manag Res，2011，3:39-47.

27 Gao J，et al.Induction of apoptosis of gastric cancer cells SGC7901 in vitro by a cell-free fraction of Tibetan kefir.Int Dairy J，2012，30:14-18.

28 Ghoneum M，et al.Apoptotic effect of a novel kefir product，PFT，on multidrug-resistant myeloid leukemia cells via a hole-piercing mechanism.Int J Oncol，2014，44:830-837.

29 Hertzler SR，et al.Kefir improves lactose digestion and tolerance in adults with lactose maldigestion.J Am Diet Assoc，2003，103:582-587.

30 Rodrigues KL，et al.Antiinflammatory properties of kefir and its polysaccharide extract.Inflammopharmacology，2005，13:485-492.

31 Huseini H，et al.Evaluation of wound healing activities of kefir products.Burns，2012，38:719-723.

32 Patel S，et al.Potentials of exopolysaccharides from lactic acid bacteria.Indian J Microbiol，2012，52:3-12.

33 Piermaria J，et al.Gelling properties of kefiran，a food grade polysaccharide obtained from kefir grains.Food Hydrocoll，2008，22:1520-1527.

34 Pintado ME，et al.Microbiological and rheological studies on Portuguese kefir grains.Int J Food Sci Technol，1996，31:15-36.

35 Katechak IE，et al.Production of hard-type cheese using free or immobilized freeze-dried kefir cells as a starter culture.J Agric Food Chem，2008，56:5316-5323.

36 Kourkoutas Y，et al.Evaluation of freeze-dried kefir coculture as starter in feta-type cheese production.Appl Environ Microbiol，2006，72:6124-6135.

37 Piermaria J，et al.Kefiran films plasticized with sugars and polyols:water vapor barrier and mechanical properties in relation to their microstructure analyzed by ATR/FT-IR spectroscopy.Food Hydrocoll，2011，25:1261-1269.

38 Motedayen AA，et al.Development and characterization of composite films made of kefiran and starch.Food Chem，2013，136:1231-1238.

39 Mantzourani I，et al.Study of kefir grains application in sourdough bread regarding rope spoilage caused by Bacillus spp.Food Chem，2014，143:17-21.

40 Beshkova D，et al.Pure cultures for making kefir.Food Microbiol，2002，19:537-544.

41 Chen T，et al.Microbiological and chemical properties of kefir manufactured by entrapped microorganisms isolated from kefir grains.J Dairy Sci，2009，92:3002-3013.

42 Nambou K，et al.A novel approach of direct formulation of defined starter cultures for different kefir-like beverage production.Int Dairy J，2014，34:237-246.

43 Gao J，et al.Culture conditions optimization of Tibetan kefir grains by response surface methodology.Proced Eng，2012，37:132-136.

44 Bekatorou A，et al.Effect of various carbohydrate substrates on the production of kefir grains for use as a novel baking starter.Food Chem，2004，88:237-242.

45 Gorsek A，et al.Quantitative examination of process parameters during kefir grain biomass production.Int J Chem React Eng，2007，5:1-7.

46 Demirhan E，et al.A modelling study on kefir grain biomass growth:Influence of various minerals.Int J Dairy Technol，2011，64:402-407.

47 Dogan M.Rheological behaviour and physicochemical properties of kefir with honey.J Verbr Lebensm，2011，6:327-332.

48 Dimitrelia G，et al.Effect of incubation temperature and caseinates on the rheological behaviour of kefir.Procedia Food Sci，2011，1:583-588.

49 Zhang Z (張喆)，et al.Fermentation technology of oat and milk with the Tibetan mushroom.China Brewing (中國釀造)，2009，212:160-164.

50 Yue C (岳春)，et al.The research of Tibetan kefir fermenting wort drink.China Brewing (中國釀造)，2012，31:183-187.

51 Oliveira Leite AM，et al.Microbiological，technological and therapeutic properties of kefir:a natural probiotic beverage.Brazilian J Microbiol，2013，44，2:341-349.

52 Yuan YL (袁祎琳)，et al.Production and quality analysis of Tibetan kefir milk slice.Trans CSAE (農業工程學報)，2013，11:278-285.