雞卵轉鐵蛋白結構與功能的關系

仉 旭，吳子健，呂瑜峰

天津市食品生物技術重點實驗室 天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134

雞卵轉鐵蛋白(hen Ovotransferrin，hOTF)，又稱卵伴白蛋白［1］，是一種非結晶單亞基糖蛋白，存在于雞蛋卵清中，約占蛋清總蛋白含量的12%～13%，分子量為76Ku，pI 6.0，含有686 個氨基酸殘基［2］。hOTF 是轉鐵蛋白家族中一個重要的成員［3］，與Fe3+離子有高度親和力，并具有抗菌［4］、抗病毒［5，6］、抗氧化［7］、抗腫瘤［8］以及免疫調節等多種活性［9］。本文回顧并總結了前人的研究成果，從分子組成以及空間結構等方面分析討論該蛋白及其水解產物具有這些生理活性的內在原因。

1 結構與抗菌活性

hOTF 可抑制許多革蘭氏陽性或陰性菌的生長，諸如屬于革蘭氏陽性菌的變形鏈球菌和蠟樣芽孢桿菌，以及屬于革蘭氏陰性菌的假單胞菌和大腸桿菌;但也有些細菌對hOTF 具有一定的抗性，如革蘭氏陰性菌的變形桿菌和克雷伯桿菌等［12，13］。目前對于hOTF 抗菌性原因的研究較為深入，有多方面的解釋。

圖1 雞卵轉鐵蛋白空間結構［10，11］Fig.1 Spacial structure of hOTF

研究者最早提出該蛋白的抗菌機理在于其能夠螯合Fe3+離子的分子結構。如圖1 所示，天然狀態的hOTF 由兩個結構相似的球形端瓣(即N 端瓣與C 端瓣)組成，每個端瓣又可分為兩個大小相似的子域(N 端瓣含N1 和N2 子域;C 端瓣含C1 和C2 子域)，且N1 和N2 子域之間以及C1 和C2 子域之間各形成一個能配位結合Fe3+離子的縫隙(cleft)。未結合Fe3+離子時，裂縫呈開放狀;但若在堿性條件下且環境中存在(或)時，位于裂縫處的4 個氨基酸殘基(N 端瓣為Asp60、Tyr92、Tyr191和His250;C 端 瓣 為Asp395、Tyr524、Tyr431 和His592)便與(或)共同作用，可緊密地結合Fe3+離子(如圖2 所示)，形成空間上呈八面體結構的OTF--Fe3+三元復合體［14，15］。天然雞卵清的pH 值大于7.0，且hOTF 大多為脫輔基狀態(即未結合Fe3+離子的狀態)，因此具有相當強的螯合Fe3+離子能力，且一旦結合則會使Fe3+離子難以逃逸。1978 年Bullen 等人［16］指出hOTF 等轉鐵蛋白螯合金屬離子的作用導致微生物生長環境中的Fe3+離子濃度降低而無法滿足菌體生長需要，特別是對于那些必須有Fe3+離子才能生長的細菌;而1981 年Valenti 等人［9］發現離子能夠有助于hOTF 對于表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等微生物的抑制作用，可能也是源于該蛋白螯合Fe3+的原因。

后來隨著研究的不斷深入，人們逐漸發現［4，13］hOTF 的抗菌性能也并非僅僅因為其捕獲并消除微生物生長環境中的Fe3+離子，如:1982 年Valenti 等人［4］的研究表明hOTF 抑制菌株Escherichia coli W1485(E.coli W1485)生長的活性并不只是由于其剝奪了培養基中的Fe3+離子，hOTF 與E.coli W1485菌體細胞直接接觸并相互作用也是發揮其抑菌作用的必要條件，且相互接觸時間越長，抑制生長的效果也越加明顯。1985 年Valenti 等人［17］發現失去結合Fe3+能力的hOTF 全蛋白(即每分子結合兩個Fe3+離子的hOTF)比脫輔基的hOTF(即未結合Fe3+離子的hOTF)顯示出更強的抗白色念珠菌(C.albicans 3153 serotype A 和C.albicans 3156 serotype B)的性能，且即使培養基中含有游離的Fe3+離子也無法促進C.albicans 的生長。綜上，人們認為hOTF 的抗菌活性可能源于更為復雜的機制，還有其它內在原因，如下文所示。

圖2 雞卵轉鐵蛋白N 端瓣鐵離子結合部位結構示意［18］Fig.2 Schematic diagram of the iron-binding site in hOTF N-lobe

hOTF 另一種可能的抗菌機制在于該蛋白含有抗菌殘基序列。1998 年Ibrahim 等人［19］報導指出hOTF 對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸桿菌等具有抗菌活性，且指出蛋白N 端瓣中的109 位至200 位間的92 個氨基酸殘基序列(又稱為OTAP-92，Ovotransferrin antimicrobial peptide-92)［9］是其所含的抗菌序列，如圖3 所示。

圖3 OTAP-92 氨基酸殘基序列Fig.3 Amino acid residues sequence of OTAP-92

第三種可能的機制在于:hOTF 可滲透過細菌細胞外膜到達細胞內膜，并引起細胞內膜對各種離子滲透選擇性的改變。2003 年Aguilera 等人［20］研究發現，透過大腸桿菌細胞外膜的hOTF 可到達細胞內膜并導致內膜選擇性地透過K+離子，而對Na+和H+離子沒有作用，結果在未顯著改變pH 梯度的情況下，細胞內膜電位顯著降低(化學電勢從-198mV 下降到-56mV)，使原本由電子傳遞鏈與氧化呼吸產能的過程解偶聯，這種情況雖未直接殺死細菌細胞，但卻使細菌停止繁殖。

人們在研究其抗菌活力大小時還發現:結合不同金屬離子的三元復合物(OTF--金屬離子)具有的抗菌活性大小不同。1987 年Valenti 等人［21］指出螯合Zn2+的hOTF 比螯合其他金屬或脫輔基狀態的hOTF 具有更強的抗菌活性，可能是由于Zn2+-OTF 復合物具有特殊活性，但該種特殊活性的深層次原因仍有待進一步研究。

2 結構與抗病毒活性

源于雞蛋卵清的hOTF 及其水解肽段具有抗病毒活性，而該活性與蛋白或肽段的結構以及氨基酸序列、序列的位置具有某種特殊的聯系。

首先hOTF 所具有的結構可能對其抗病毒活性具有十分重要的作用。hOTF 與乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)具有49%的同源性［22］以及相似的空間結構(如圖1 和圖4 所示)，Lf 也是由兩個類似的端瓣(N 端瓣和C 端瓣)組成，每個端瓣也折疊形成兩個大小相近的子域(N 端瓣含N1 和N2 子域;C 端瓣含C1 和C2 子域)，且子域間各形成一個Fe3+離子結合位點。人們很早就發現Lf 具有抗病毒活性［23，24］，如其可抗單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)1 型和2 型、人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus)以及艾滋病毒(human immunodeficiency virus)的性能。后來研究發現hOTF 也同樣具有抗病毒的活性，如:2002 年Giansanti 等人［5］的研究顯示hOTF 可抗一種禽類皰疹病毒-馬雷克病皰疹病毒(Marek＇s disease virus，MDV)，且活性優于牛乳鐵蛋白(Bovine Lactoferrin，BLf)和血清轉鐵蛋白(Serum Transferrin，Trf)，同時指出其抗病毒效力與該蛋白本身結合Fe3+離子的程度無關;并推測hOTF 抗MDV 病毒的作用是基于蛋白分子可抑制病毒顆粒對細胞的吸附作用，進而降低細胞的感染率，阻礙病毒繁殖與復制，這種推斷與1996 年Marchetti 等人［25］提出的BLf 和人乳鐵蛋白(Human Lactoferrin，HLf)抑制HSV-Ⅰ的機理十分相似。

圖4 人乳鐵蛋白空間結構［10］Fig.4 Spacial structure of human lactoferrin

其次，該蛋白含有具抗病毒活性的肽段。2005年Giansanti 等人［6］研究發現源于hOTF 的兩種肽段(如表1 所示)可有效防止MDV 病毒對雞胚胎纖維母細胞(chicken embryo fibroblasts)的侵染，并分別與源于BLf 的兩種抗病毒活性肽段(如表1 所示)具有序列同源性，其中hOTF 219-227 與BLf 222-230都含9 個氨基酸殘基，且有6 個氨基酸殘基是相同的(即Asp-Gln-Tyr-Glu-Leu-Leu);而hOTF 269-301、hOTF 633-638 與BLf 264-269 都含6 個氨基酸殘基，且Asp-Leu 和Lys 所在位置相同。對比后發現hOTF 219-227、hOTF 269-301 和hOTF 633-638 的抗病毒能力是BLf 222-230 和BLf 264-269 的兩倍，進一步研究發現這些肽段都分布在各自源蛋白分子的表面，但目前這些肽段所含有的帶正電荷氨基酸殘基、疏水性氨基酸殘基以及肽段長度對于hOTF 和BLf 蛋白的空間構象以及它們所具有的抗病毒活性(包括多肽的抗病毒活性)的作用仍有待進一步研究。

表1 牛乳鐵蛋白與雞卵轉鐵蛋白抗病毒活性肽段的比較［6］Table 1 Comparison of antiviral activity fragments of bovine lactoferrin and hen ovotransferrin

3 結構與清除自由基、抗氧化活性

hOTF 所具有的清除自由基以及抗氧化性能體現在以下幾個方面:首先，天然狀態下hOTF 維持著雞胚發育早期階段的氧化還原平衡［7，26］，并且2007年Ibrahim 等［7］發現hOTF 清除氧自由基的能力和超氧化物歧化酶(SOD)相似，且優于抗壞血酸或血清白蛋白等目前已知的抗氧化劑;其次，Ibrahim等［7］還發現結合了金屬離子的hOTF 比脫輔基的hOTF 本身具有更強的清除自由基的能力，其中結合了Cu2+離子的hOTF 清除能力最高，其它依次為Mn2+、Fe3+以及Zn2+;第三，hOTF 兩個端瓣(即N-端瓣和C-端瓣)的清除自由基性能也高于完整的hOTF，特別是N 端瓣的作用，可能原因在于其分子內二硫鍵被還原后所引起的hOTF 結構改變［7］，hOTF 是一種對氧化還原環境非常敏感的蛋白，還原條件下(如在二硫蘇糖醇等還原劑存在下)會在不同位點自行裂解，并且還原作用會導致蛋白內部產生一些具還原性的自由巰基(甚至引起蛋白內二硫鍵的重排)，這些自由巰基具有極強的清除自由基功能［27］;最后，酶解hOTF 得到的產物清除自由基的能力高于hOTF 本身，2013 年Moon 等［28］研究表明經復合蛋白酶(芽孢桿菌蛋白酶復合體)、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶或木瓜蛋白酶各自水解得到的OTF 酶解產物所具有的清除超氧陰離子活性比完整的hOTF 高出3.2 至13.5倍。

4 結構與抗腫瘤活性

hOTF 及其水解物具有一定的抗腫瘤活性。2009 年Ibrahim 等人研究表明［8］hOTF 在三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(tris (2-carboxyethyl)phosphine)還原作用下，肽鏈上特定的位點(如圖5 中箭頭所指的位點)發生巰基關聯的自我裂解(thiol-linked autocleavage)，所產生的肽段能抑制人源乳腺癌細胞系MCF-7(ATCC HTB-22)和人源結腸癌細胞系HCT-116(ATCC CCL-247)的生長，且呈劑量依賴關系，但對正常人源乳腺上皮細胞(normal human mammary epithelial cells)無毒害作用。2013 年Moon等人［28］研究發現hOTF 及其酶解產物(Ovotransferrin enzyme hydrolysates，OTH)可抑制人源肺癌細胞系A549(ATCC CCL-185)、人源胃癌細胞系AGS(ATCC CRL-1739)，人源乳腺癌細胞系MCF-7(ATCC HTB-22)、人源肺癌細胞系SK-MES-1(ATCC HTB-58)、人源喉癌細胞系Hep-2(ATCC CCL-23)、人源宮頸癌細胞系HeLa(ATCC CCL-2)以及人源肝母細胞瘤HepG2(ATCC HB-8065)的生長，而且存在劑量依賴關系，特別是40mg/ml 劑量的hOTF 顯示出對腫瘤細胞更高的細胞毒性。

圖5 雞卵轉鐵蛋白N 端瓣與C 端瓣自動裂解區域氨基酸序列［26］Fig.5 Amino acid sequences of autocleavage regions in the N-and C-lobes of hOTF

hOTF 中有四個較為特殊的三肽模體［26］，分別為N-端瓣的CHT(hOTF 115-117)和HTT(hOTF 210-212)，以及C-端瓣的HST(hOTF 542-544)和CHT(hOTF 454-456)，如圖5 所示。2006 年Ibrahim等人［26］研究表明在硫氧還蛋白系統或二硫蘇糖醇等還原劑的條件下，hOTF 中這四個三肽模體會發生自動裂解。其中肽段hOTF 115-211 和肽段hOTF 454-544 所含的半胱氨酸殘基相對保守，可穩定生成兩個典型的Kringle 結構域，即Kringle N 和Kringle C，如圖6 所示。而hOTF 及其裂解物抑制腫瘤細胞生長的活性可能正是源于其結構中的Kringle 結構域(Kringle domain)。Kringle 結構域也稱為環狀結構域，是由3 個二硫鍵組成的穩定的雙環狀結構域［29］。同時hOTF 通過自動裂解形成Kringle 結構域的方式與此前已知的纖溶酶原類似，源于牛乳的纖溶酶原在癌細胞分泌的還原酶或其它還原條件下可使自身二硫鍵還原并自動裂解形成血管生成抑制因子［30］，血管生成抑制因子由纖溶酶原的Kringle 1-4 和Kringle 5 結構域組成，早先的研究［31，32］證明，血管生成抑制因子中的這些Kringle 結構域［33，34］可以抑制腫瘤生長，因為其可通過與內皮細胞的受體結合抑制內皮細胞的增殖和遷移，從而抑制腫瘤新生血管的生成，發揮抗腫瘤活性［35］。

圖6 雞卵轉鐵蛋白中兩個Kringle 結構域示意圖Fig.6 Schematic diagram of two Kringle domains from hOTF

5 機構與免疫調節活性

雞卵轉鐵蛋白(hen egg-white ovotransferrin，hOTF)與雞血清轉鐵蛋白(hen serum transferrin，hST)是雞機體內不同合成場所形成的兩種蛋白(hST 在肝臟中合成［5］;hOTF 在輸卵管中合成［36］)，但都是由相同基因編碼得到的氨基酸序列相同的蛋白，同樣具有兩個可以結合Fe3+離子的端瓣以及相似的整體構象，只是蛋白一級結構中糖基化修飾有所差異(hST 糖基位點為Asn52［37］;hOTF 糖基位點為Asn473［15］)，并且糖基化的差異可能造成了蛋白中兩個端瓣的相對取向的不同。在禽類和哺乳類動物還未分化前的侏羅紀時代，轉鐵蛋白家族成員同時要肩負著Fe3+離子運輸和機體防御功能，如今作為進化較先進的哺乳動物，這兩種功能分別由Trf與Lf 來承接［5，6］，而禽類動物中仍然由hOTF 同時承擔。

hST 屬于急性期蛋白(acute phase protein，APP)。通常急性期蛋白是一種在炎癥、細胞損傷等條件下，由促炎性細胞因子誘導的在肝臟中合成的一類參與急性期反應的蛋白質，具有免疫調節以及修復生理平衡等作用［38，39］。hST 與其他轉鐵蛋白家族成員同屬于先天免疫系統的組成部分，其表達水平會在炎癥或疾病期間有所提升，并通過免疫調節作用平衡生物內穩態［9］。2002 年Xie 等人［40］指出，在Escherichia coli(E.coli)、禽痘病毒、呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病毒以及傳染性喉氣管炎病毒介導的炎癥反應期間，雞機體內的hST 含量明顯提高。同年Xie 等人［41］又利用hST 分別刺激雞的巨噬細胞(HD-11 細胞)和異嗜性白細胞，均產生了白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，并增強了呼吸爆發活性，引發了異嗜性白細胞的脫顆粒現象，表明hST 具有介導補體啟動、促進吞噬作用、產生細胞因子、并清除炎癥刺激以及恢復內穩態的作用。1997 年Otani等人［42］研究發現hST 可以抑制由細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和植物凝集素(phytohemagglutinin，PHA)誘導的小鼠脾臟淋巴細胞的增殖，并推測這種抑制增殖的作用與Fe3+飽和度無關，也并非是因為LPS 或PHA 等有絲分裂原的失活，而是淋巴細胞或其輔助細胞與蛋白分子相互作用的結果。Rath 等人［43］2009 年的報導中指出，hST 在雞血清中的波動水平與炎癥以及微生物的應激相關，因此hST 可作為一種生物學標記用于診斷小雞機體發生的炎癥性疾病。

6 總結與展望

目前研究者對于雞卵轉鐵蛋白天然存在的結構與其抗菌性能、抗病毒性能等的關系已有較深入的研究，但對于其結構與所具有的抗氧化、抗腫瘤以及免疫調節活性的關系仍需進一步研究，同時卵轉鐵蛋白作為食源性蛋白，在被人類食用之前要經過一系列加工過程，不同加工方法所引起的結構變化與其功能的關系鮮有報道，也有待深入探討。

1 Williams J.A comparison of glycopeptides from the ovotransferrin and serum transferrin of the hen.Biochem J，1968，108:57-67.

2 Jeltsch JM，Chambon P.The complete nucleotide sequence of the chicken ovotransferrin mRNA.Eur J Biochem，1982，122:291-295.

3 Mazurier J，et al.Human lactotransferrin:molecular，functional and evolutionary comparisons with human serum transferrin and hen ovotransferrin.Experientia，1983，39:135-141.

4 Valenti P，et al.Antibacterial activity of matrix-bound ovotransferrin.Antimicrob.Agents Chemother，1982，21:840-841.

5 Giansanti F，et al.Antiviral activity of ovotransferrin discloses an evolutionary strategy for the defensive activities of lactoferrin.Biochem Cell Biol，2002，80:125-130.

6 Giansanti F，et al.Antiviral activity of ovotransferrin derived peptides.Biochem Biophys Res Commun，2005，331(1):69-73.

7 Ibrahim HR，et al.Ovotransferrin possesses SOD-like superoxide anion scavenging activity that is promoted by copper and manganese binding.Int J Biol Macromol，2007，41:631-640.

8 Ibrahim HR，Kiyono T.Novel anticancer activity of the autocleaved ovotransferrin against human colon and breast cancer cells.J Agric Food Chem，2009，57:11383-11390.

9 Wu J，Acero-Lopez A.Ovotransferrin:structure，bioactivities，and preparation.Food Res Int，2012，46:480-487.

10 Mizutani K，et al.X-ray structures of transferrins and related proteins.Biochim Biophys Acta (BBA)-General Subjects，2012，1820:203-211.

11 Kurokawa H，et al.Crystal structure of diferric hen ovotransferrin at 2.4 ? resolution.J Mol Biol，1995，254:196-207.

12 Mine Y，Kovacs-Nolan J.New insights in biologically active proteins and peptides derived from hen egg.World Poultry Sci J，2006，62:87-96.

13 Valenti P，et al.Studies of the antimicrobial activity of ovotransferrin.Int J Tissue React，1982，5:97-105.

14 Giansanti F，et al.Physiological roles of ovotransferrin.Biochim.Biophys.Acta (BBA)-General Subjects，2012，1820:218-225.

15 Kurokawa H，et al.Crystal structure of hen apo-ovotransferrin both lobes adopt an open conformation upon loss of iron.J Biol Chem，1999，274:28445-28452.

16 Bullen JJ，et al.Role of iron in bacterial infection.Current topics in microbiology and immunology，Berlin:Springer Berlin Heidelberg，1978，Vol 80，1-30.

17 Valenti P，et al.Antifungal activity of ovotransferrin towards genus Candida.Mycopathologia，1985，89:169-175.

18 Mizutani K，et al.Domain closure mechanism in transferrins:new viewpoints about the hinge structure and motion as deduced from high resolution crystal structures of ovotransferrin N-lobe.J Mol Biol，2001，309:937-947.

19 Ibrahim HR，et al.Identification of a distinct antibacterial domain within the N-lobe of ovotransferrin.Biochim Biophys Acta (BBA)-Molecular Cell Research，1998，1401:289-303.

20 Aguilera O，et al.Transferrins selectively cause ion efflux through bacterial and artificial membranes.FEBS Lett，2003，548:5-10.

21 Valenti P，et al.The effect of saturation with Zn2+and other metal ions on the antibacterial activity of ovotransferrin.Med Microbiol Immun，1987，176:123-130.

22 Metz-Boutigue MH，et al.Human lactotransferrin:amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins.Eur J Biochem，1984，145:659-676.

23 Hasegawa K，et al.Inhibition with lactoferrin of in vitro infection with human herpes virus.Jpn Med J，1994，47(2):73-85.

24 Seganti L，et al.Antiviral activity of lactoferrin towards naked viruses.Biometals，2004，17:295-299.

25 Marchetti M，et al.Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type 1 adsorption to Vero cells.Antivir Res，1996，29:221-231.

26 Ibrahim HR，et al.Ovotransferrin is a redox-dependent autoprocessing protein incorporating four consensus self-cleaving motifs flanking the two kringles.Biochim Biophys Acta(BBA)-General Subjects，2006，1760:347-355.

27 Biswas S，et al.Redox modifications of protein-thiols:emerging roles in cell signaling.Biochem Pharmacol，2006，71:551-564.

28 Moon SH，et al.Screening for cytotoxic activity of ovotransferrin and its enzyme hydrolysates.Poultry Sci，2013，92:424-434.

29 Shen L(申樂)，Chen BS(陳保生).The structure and function of the kringle domain in human apolipoprotein (a).Chem of Life(生命的化學)，2007，27:418-421.

30 Su DX(蘇東曉)，et al.Research advances in anticancer properties of angiostatin.Nat Sci J Hainan Univ(海南大學學報，自科版)，2009，27:297-301.

31 Stathakis P，et al.Angiostatin formation involves disulfide bond reduction and proteolysis in kringle 5 of plasmin.J Biol Chem，1999，274:8910-8916.

32 O＇Reilly MS，et al.Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell，1994，79:315-328.

33 Li ZL(李壯林)，et al.Expression and purification of human angiostatin kringles 1-3 and the research of biological activity.China Biotechnol(中國生物工程雜志)，2011，31:24-28.

34 Cai WB(蔡衛斌)，et al.The effect of inhibiting angiogenesis of plasminogen Kringle 5.Progr Physiol Sci (生理科學進展)，2004，35:159-162.

35 Wu JX(吳江雪)，et al.Reseach advancement of endogenous angiogenesis inhibitors.Chin J Cancer Res(癌癥)，2005，3:376-384.

36 Fabiana S，et al.Bioactive egg compounds.New Delhi:Springer，2007.43-50.

37 Guha TP，et al.Structure of diferric hen serum transferrin at 2.8 A resolution.Acta Crystallogr，Sect D:Biol Crystallogr，2003，59:1773-1781.

38 Xie H，et al.Inflammation-induced changes in serum modulate chicken macrophage function.Vet Immunol Immunop，2001，80(3):225-235.

39 Zhang Y(張勇)，et al.Acute phase proteins and their function during animal stress process.Chin J Animal Nutri(動物營養學報)，2011，23:1877-1883.

40 Xie H，et al.Changes in serum ovotransferrin levels in chickens with experimentally induced inflammation and diseases.Avian Dis，2002，46:122-131.

41 Xie H，et al.Effects of ovotransferrin on chicken macrophages and heterophil-granulocytes.Dev Comp Immunol，2002，26:805-815.

42 Otani H，Odashima M.Inhibition of proliferative responses of mouse spleen lymphocytes by lacto-and ovotransferrins.Food Agr Immunol，1997，9:193-201.

43 Rath NC，et al.Serum ovotransferrin as a biomarker of inflammatory diseases in chickens.Poultry Sci，2009，88:2069-2074.