排風藤內生真菌PFT-2 發酵產物抗氧化活性研究

楊 揚，蘇香萍*，李則君，汪鋆植，2，鄒 坤，2

1三峽大學生物與制藥學院;2 三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，宜昌 443002

植物內生菌(entophytic fungal)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙的真菌或細菌［1］。許多研究［2-4］表明，植物內生菌能產生多種全新的活性物質，作為生物防治資源、外源基因的載體和新藥的來源，在農業、醫藥、食品衛生領域有著巨大的應用潛力。

排風藤(Solanum cathayanum)為茄科植物千年不爛心的干燥全草，為植物白英的全草［5］。夏秋采收，曬干，生用，亦用鮮品。生長于海拔200～1400 m 處山坡陰濕處及灌木叢中，主產于三峽地區的巴東、長陽、秭歸、興山以及神農架，全國大部分地區均有分布［6］。排風藤其性微寒，味苦，具有清熱利濕、解毒消腫之功效，且富含生物堿、黃酮、萜類和甾體等化合物［7］，具有抗炎、保肝護肝和抗氧化活性［8，9］。

文獻［10］從排風藤中分離得到18 株菌株，其中兩株菌株的代謝產物的抗菌活性較強。目前國內外對排風藤的研究主要集中在排風藤藥材提取物的成分和活性［8，9］，而未見排風藤內生真菌代謝產物生物活性的研究報道。本文對排風藤內生真菌PFT-2進行發酵擴大培養，并對各提取物做抗氧化活性的研究，為排風藤內生真菌的這一微生物資源的研究開發提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 出發菌株

排風藤內生真菌PFT-2 (Rhizoctonia.sp.PFT02)，本實驗室提供并培養。

1.2 實驗試劑

二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)，Sigma 公司;石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、Vc、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸均為國產分析純試劑。

1.3 實驗儀器

UV-3100 型紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠;GSP-9270MBE 隔水式恒溫培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠;EYELA旋轉蒸發儀旋轉蒸發器;超凈工作臺，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

2 實驗方法

2.1 培養基

PDA 液體發酵培養基的制備:稱取2000 g 馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水煮沸0.5 h，紗布過濾，定容至10 L，再加蔗糖200 g，充分溶解，分裝于三角瓶，200 mL/500 mL 瓶，121 ℃，滅菌30 min。

2.2 種子液制備

將本實驗室分離保藏的菌株排風藤PFT-2 菌株接種到PDA 斜面培養基中活化，28 ℃恒溫培養箱培養7 d，觀察菌株生長狀態，是否和母斜面相同。將活化好的PFT-2 菌株接種到PDA 液體發酵培養基中，28 ℃恒溫搖床培養3 d 左右，記錄觀察發酵液特征，如正?？山尤氚l酵培養基擴大培養。

2.3 發酵培養

將上述種子液按照5%的接種量接種到8 L 的PDA 液體發酵培養基中，即40 瓶200 mL/500 mL裝的錐形瓶，28 ℃恒溫搖床培養14 d，觀察發酵液狀態，菌絲體形態大小、顏色及密度不再變化為準。

2.4 代謝產物分離提取和樣品制備

發酵液萃取:將發酵液用4 層紗布過濾，發酵濾液用等體積的乙酸乙酯萃取，萃取發酵液三次，直至顏色為無色。合并萃取液，置于圓底燒瓶中，旋轉蒸發去除溶劑，得發酵液乙酸乙酯萃取物。

菌絲體提取:發酵液過濾后菌絲體，先60 ℃烘干，再研磨成粉，稱取各菌株菌絲100 mL，用800 mL甲醇超聲萃取3 次，每次30 min 冷浸抽提，合并提取物旋蒸濃縮得到菌絲體甲醇總提物。取適量菌絲體甲醇總提物用蒸餾水混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，丙酮、甲醇提取得到菌絲體甲醇總提物各部位，即石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、丙酮提取物、甲醇提取物、水層剩余物和水不溶物，將所有提取物冷藏于冰箱中，備抗氧化活性測定之用。

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH·清除能力［11，12］

向試管中依次加入1.0 mL 0.15 mmol/L DPPH·溶液和1.0 mL 甲醇，總體積為2.0 mL，混勻20 min后，測定吸光度(A 為517 nm)，記為A0;加入1.0 mLDPPH·溶液和1.0 mL 待測試樣溶液，測定值記為Ai;加入1.0 mL 甲醇和1.0 mL 待測試樣溶液，測定值記為Aj，按下式計算DPPH·清除率。

樣品清除DPPH·能力采用IC50值表示。并以維生素C(Vc)作抗氧化活性對照實驗。

2.5.2 Fe3+還原力的測定［13］

準確稱取樣品100 mg，溶劑溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度為10 mg/mL 樣品溶液，稀釋成不同質量濃度，取2.5 mL 各濃度的樣品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖液及2.5 mL 1%鐵氰化鉀，50 ℃水浴反應20 min 后，急速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液混勻，0.2 μm 水相濾膜過濾，取上清液5 mL，加入5 mL 0.02%三氯化鐵溶液混勻，10 min 后于700 nm 波長處測定吸光度A。吸光度越大則還原能力越大，以VC作為陽性對照。

3 結果與討論

3.1 發酵液的培養狀態

PFT-2 內生真菌接種發酵培養到第5 d 時，菌絲球的顏色由乳白色逐漸變為黃色，其大小均勻，發酵液無色澄清;PFT-2 內生真菌發酵培養到第12 d 時，菌絲球變為墨綠色，并且大部分菌絲球變得松散呈絮狀，發酵液仍為澄清無色，此狀態持續到第14 d發酵結束。

3.2 發酵液乙酸乙酯萃取物和菌絲體甲醇總提物抗氧化活性結果

DPPH·是一類較為穩定的芳香類自由基，天然抗氧化物質對DPPH·的清除能力被認為是抗氧化物質清除自由基的總能力，因此DPPH·法被廣泛用于各種物質體外抗氧化活性的研究中。另外Fe3+還原能力的測定，可檢驗提取物是否為良好的電子供應體，提取物通過提供電子使Fe3+還原為Fe2+，根據體系吸光度的大小可以反應出提取物的還原力強弱，吸光度越大，還原力越強，說明其抗氧化活性就越強。

表1 各樣品對DPPH·的清除率Table 1 Scavenging rates of samples against DPPH· %

由表1 可知，乙酸乙酯萃取PFT-2 內生真菌的濾液，甲醇浸泡粗提的PFT-2 內生真菌的菌絲體，兩個樣品都對DPPH·均有一定的清除活性，并且在一定質量濃度范圍內，清除DPPH·的能力均隨著樣品物質量濃度的增大而增強，而在實驗的質量濃度范圍內，菌絲體甲醇總提物在各質量濃度條件下清除DPPH·的能力明顯強于發酵液乙酸乙酯萃取物，則選擇菌絲體甲醇總提物做進一步的抗氧化活性研究。

3.3 菌絲體甲醇總提物的不同極性部位的抗氧化活性

由圖1 可知，在一定質量濃度范圍內，菌絲體甲醇總提物的各極性部位對DPPH·的清除作用呈隨濃度增大而增加趨勢，但當達到一定濃度后樣品對DPPH·的清除率隨濃度增大，變化趨于平緩，同時各種提取物對DPPH·的清除效果與提取劑的極性也有一定關系，清除效果較好的物質主要集中在甲醇、正丁醇、丙酮等極性較大的溶劑中。在實驗的質量濃度范圍內，不同有機溶劑的萃取物在各質量濃度條件下清除DPPH·的能力為:VC＞菌絲體甲醇提取物＞菌絲體正丁醇部位＞菌絲體甲醇總提物＞菌絲體乙酸乙酯部位＞菌絲體丙酮提取物＞水層剩余物＞菌絲體氯仿部位＞菌絲體石油醚部位，故PFT-2 內生真菌次級代謝產物中抗氧化活性成分主要分布在甲醇提取物，當質量濃度達到5.000 mg/mL 時，其清除率達到83.3%。活性最差的在石油醚部位，當質量濃度達到5.000 mg/mL 時，其清除率僅為38.1%。

圖1 菌絲體甲醇總提物的不同極性部位對DPPH·的清除率Fig.1 DPPH· scavenging rates of different polar fractions of the total methanol extract from mycelium

3.4 菌絲體甲醇總提物各部位樣品對DPPH·清除活性IC50值的影響

由表2 可見，萃取物或提取物對DPPH·清除活性IC50值順序為:甲醇提取物＜VC＜丙酮提取物＜正丁醇部位＜甲醇總提物＜乙酸乙酯部位＜水層剩余物＜氯仿部位＜石油醚部位。IC50越小說明對DPPH·的清除效果越好，在各種提取物中，甲醇提取物的活性最強。IC50值最大的為石油醚提取物4.510 mg/mL。

表2 菌絲體甲醇總提物的不同極性部位對DPPH·清除活性的IC50值Table 2 IC50values of different polar fractions of the total methanol extract from mycelium in DPPH· assay

圖2 菌絲體甲醇總提物的不同極性部位對Fe3+還原力曲線Fig.2 Fe3+ reducing power curves of different polar fractions of the total methanol extract from mycelium

3.5 菌絲體甲醇總提物的不同極性部位對Fe3+還原力測定

由圖2 可看出，PFT-2 內生真菌次級代謝產物的提取物對Fe3+具有較強的還原能力，其還原能力強弱為:甲醇提取物＞丙酮提取物＞正丁醇部位＞甲醇總提物＞VC＞乙酸乙酯部位＞水層剩余物＞氯仿部位＞石油醚部位。其中乙酸乙酯部位、水層剩余物、氯仿部位表現出與VC相當的還原能力，甲醇部位、丙酮提取物、正丁醇部位、甲醇總提物明顯強于VC;石油醚部位還原能力弱于VC。

4 結論

在DPPH·的清除實驗中，從清除率及IC50來看，排風藤PFT-2 內生真菌的次級代謝產物中抗氧化物質應該主要是一些強極性物質，這些物質容易被甲醇、正丁醇、丙酮等極性溶劑提取獲得，而氯仿、石油醚等溶劑提取所得的弱極性物質活性很低或者不具活性。

在Fe3+還原力的測定實驗中，排風藤PFT-2 內生真菌的次級代謝產物的提取物的還原力強弱順序為:甲醇提取物＞丙酮提取物＞正丁醇部位＞甲醇總提物＞VC＞乙酸乙酯部位＞水層剩余物＞氯仿部位＞石油醚部位，與DPPH·的清除實驗所得結果基本一致。

DPPH·法和Fe3+還原力測定結果表明，排風藤PFT-2 內生真菌的次級代謝產物具有較強的清除DPPH·能力。排風藤PFT-2 內生真菌可大規模固體培養，且培養基價格低廉，培養條件容易控制，其次生代謝產物有望開發為天然抗氧化劑，并有可能開發為活性抗氧化單體的天然來源。

1 Petrini O.Fungal endophytes of tree leaves.In:Microbial Ecology of Leaves (Eds Andrews JH，，Hirano SS).New York:Spring-Verlag，1991:179-197.

2 Kulnar D，Siva S，Cheung H，et al.In vitro studies of endophytic fungi from Triptreygium wilfordii with anti-proliferative activity on human peripheral blood mononuclear cells.J Ethnopharmacol，2004，94:295-300.

3 Wagellaar MM，Clardy J.Dicerandrols，new antibiotic and cytotoxic dimers produced by the fungus Phomopsis longicolla isolated from an endangered mint.Nat Prod Res，2001，64:1006-1009.

4 Sessitsch A，Reiter B，Berg G.Endophytic bacterial communities of field-grown potato plants and their plant-growth promoting and antagonistic abilities.Canadian J Microbiol，2004，50:239-249.

5 Zuo XM(左小明)，Deng ZS(鄧張雙)，Guo ZY(郭志勇)，et al.Isolation and identification of chemical constituents of Solanum cathayanum.J Huazhong Norm Univ，Nat Sci(華中師范大學學報，自科版)，2012，3:322-323.

6 Fu SX(傅書遐).Flora of Hubei (湖北植物志).Wuhan:Hubei Science and Technology Press，2002.517-518.

7 Xie MX(謝明霞)，Zhou Y(周媛)，Zou K(鄒坤).Chemical constituents of Solanum cathayanum.J Chin Med Mater (中藥材)，2008，31:1332-1334.

8 Xie MX(謝明霞)，Wang JZ(汪鋆植)，Zhou Y(周媛)，et al.Protective effect of Solanum cathayanum extracts and compounds on acute liver injury.Pharm Clin Chin Mater Med(中藥藥理與臨床)，2009，25(3):51-53.

9 Huang SL(黃少蘭)，Dong WJ(董文娟)，Xue YH(薛艷紅)，et al.Protective effect of Solanum cathayanum alkaloid on H2O2induced SH-damage in SY5Y cells.Jiangsu J Tradit Chin Med(江蘇中醫藥)，2011，9:90-93.

10 Su XP(蘇香萍)，Hu GH(胡格華)，Wu J(吳軍)，et al.Isolation and antimicrobial activities of endophytic fungi in Solanum cathayanum.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥)，2012，6:337-339.

11 Guo XL(郭夏麗)，Luo LP(羅麗萍)，Leng TT(冷婷婷)，etal.Chemical compositions and antioxidant activities of seven honeys from different floral sources.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2010，22:665-670.

12 Nie SP(聶少平)，Xie MY(謝明勇)，Luo Z(羅珍).Studies on antioxidant activity of tea polysaccharide.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2005，17:549-552.

13 Deng J(鄧靖)，Mo ZC(莫正昌)，Ji GQ(汲廣全)，et al.Antioxidant activity of extract from Balanophora spicata Hayata in vitro.Food Scince(食品科學)，2010，31(5):23-25.