響應面法優化火棘總酚含量測定方法

張 煥，董光耀，舒 暢，王俊杰，陳西喆，鄢又玉*

1武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢 430023;2 湖北神農蜂語生物產業有限公司，十堰 442000

火棘［Pyracantha fortuneana (Maxim.)Li］為常綠灌木或小喬木，主產于川、滇、黔、陜、鄂、湘、粵、桂、閩、浙、皖、蘇等我國南方山區及丘陵地帶，資源極其豐富，目前已被國家衛生部批準作為食品新資源食用果品［1］。其果實富含多酚成分［2，3］，植物多酚具有抗氧化［4］、抗腫瘤，延緩衰老、免疫調節［5，6］等多種生物活性。

目前用于植物多酚的含量檢測方法較多，主要有分光光度法［7］、近紅外光譜法［8］以及色譜法［9，10］等。其中分光光度法因對設備的要求不高，操作簡單而得到最廣泛應用。主要包括酒石酸亞鐵比色法［11］、福林酚比色法［12］和高錳酸鉀滴定法［13］等，其中福林酚法應用最為廣泛。但不同資料所報道的用于總酚測定的福林酚比色法檢測條件卻存在很大的差異［12，14-19］，主要表現在:①最大檢測波長不一致，有以680、725、740、750、760、765、780 nm 等為測定波長;②福林酚試劑與堿液Na2CO3含量及比例各不相同，有1∶1、1∶2、1∶3 及1∶5 等;③Na2CO3溶液濃度差別很大，有5% (w/v)、7.5%、10%、15%、20%、飽和濃度等;④顯色時間分布在30～120 min等;⑤顯色溫度20～60 ℃不等。因此很有必要對影響福林酚顯色的因素進行系統考察，以確定最優檢測條件。目前對火棘中多酚化合物的定量測定方法尚未見報道。為了更好地開發利用火棘植物中的功效成分，本文通過響應面優化建立了福林酚比色法檢測火棘總酚含量的定量方法，此方法也可推廣應用于其它植物總酚的含量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

Lambda 25 型紫外-可見光分光光度計(美國PE公司)，CR 22G 高速冷凍離心機(日本HATACHI 公司)，Molelement1018a 型摩爾超純水機(上海摩勒科學儀器有限公司)，萬分之一電子天平(德國賽多麗斯公司);高速萬能粉碎機(天津市泰斯特實驗設備有限公司);HSJ 系列恒溫水浴攪拌器(金壇市科析儀器有限公司);STARTER 2100 實驗室pH 計(奧豪斯儀器有限公司)。

沒食子酸標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110831-201403)，福林酚試劑(sigma 公司)，碳酸鈉、乙醇等均為國產分析純。

火棘果，2014 年11 月中旬采自湖北恩施來鳳地區，經華中科技大學植物學博士楊悅鑒定為全緣火棘Pyracantha atalantioides 的果實。

1.2 實驗方法

1.2.1 火棘多酚提取物的制備

取干燥、粉碎過20 目篩的火棘果粉末20 g，加體積分數45%乙醇200 mL 于92 ℃冷凝回流提取2 h，減壓抽濾，濾液定容于200 mL，濃度以火棘干物質質量計為100 g/L，離心，收集上清液0～4 ℃冷藏備用。

1.2.2 火棘多酚的測定

取1.2.1 中稀釋100 倍后的火棘多酚提取液1 mL，加入0.4 mol/L 福林酚試劑5 mL，混勻后，再加入170 g/L 的Na2CO3溶液1 mL，補充雙蒸水至總體積為10 mL，混勻(后續試驗均依照此體系執行)，于25 ℃避光恒溫水浴反應1 h，冰水冷卻，室溫條件下于765 nm 波長處測定吸光度。

1.2.3 最大吸收波長的確定

取適宜濃度的火棘多酚提取液及沒食子酸標準品溶液各1 mL，參照1.2.2 顯色反應后，室溫條件下于200～900 nm 全波段掃描，以確定最大吸收波長。

1.2.4 反應體系的確定

以10 μg/mL 沒食子酸標準品溶液1.0 mL 作為研究對象，確定福林酚法檢測總酚含量的最佳反應體系。分別考察了福林酚試劑的濃度(mol/L)及用量(mL)、Na2CO3溶液的濃度(g/L)及用量(mL)、水浴時間(min)及溫度(℃)對總酚含量測定的影響以及火棘總酚溶液體系pH 值及火棘總酚提取液中乙醇體積濃度(%)等因素對火棘總酚含量測定的影響。

影響火棘多酚含量測定的單因素考察

1.2.5 影響火棘多酚含量測定的單因素考察

在1.2.4 的基礎上，確定多酚檢測的反應體系為V待測溶液∶V福林酚試劑∶V碳酸鈉溶液=1∶5∶1，以此反應體積比為模板，繼續深入探討福林酚試劑及Na2CO3溶液的濃度、水浴時間及溫度、火棘總酚溶液體系pH 值及火棘總酚提取液中乙醇體積濃度對火棘多酚測定的具體影響。

1.2.6 響應面優化實驗

在1.2.5 項的基礎上，以吸光度為評價指標，固定待測溶液及反應體系，確定福林酚的濃度為0.4 mol/L，選擇對火棘多酚檢測影響顯著的3 個因素:水浴時間、水浴溫度及Na2CO3溶液的濃度，按照Box-Behnken 設計，具體見表1。

表1 Box-Behnken 設計因素水平及編碼值Table 1 Levels and factors of response surface tests

1.2.7 方法學驗證

經過響應面優化得到火棘多酚含量檢測的最優條件后，我們確定了沒食子酸的標準曲線及火棘多酚的工作曲線，并進行重復性、重現性、穩定性、回收率等方法學驗證實驗。

2 結果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

參照1.2.3 設計，結果表明火棘多酚提取液及沒食子酸標準品溶液均在765 nm 處達到最大吸收，故可選765 nm 作為最大檢測波長。

2.2 反應體系的確定

參照1.2.4 設計，結果分別見圖1(A～E)。

圖1 福林酚試劑的用量(A)及濃度(B)、Na2CO3溶液的用量(C)及濃度(D)、水浴時間及溫度(E)對火棘總酚含量測定的影響Fig.1 Effects of amount (A)and concentration (B)of Folin-Ciocalteu reagent，amount (C)and concentration (D)of Na2CO3，Incubation time and temperature (E)on total polyphenols of P.fortuneana

由圖1(A)可知，隨著福林酚用量的增加，吸光度逐漸增加，至福林酚體積5 mL 時達到最大，此后趨于平緩，因此，福林酚添加量選為5 mL。由圖1(B)可知，福林酚濃度增加時，吸光度逐漸升高，當濃度超過0.2 mol/L 時增幅趨緩，故選擇福林酚濃度為0.2 mol/L 繼續研究。由圖1(C)及圖1(D)可知，隨著Na2CO3溶液體積及濃度的增加，吸光度先快速增加后趨于平緩，添加量為1.0 mL，濃度為150 g/ L 時達到最大，因此Na2CO3溶液添加量選為1.0 mL，濃度為150 g/ L。由圖1(E)可知，隨著水浴溫度的增加，吸光度先增后減，25 ℃時，達到最大值，當溫度繼續增加時，體系穩定性下降;隨著水浴時間的延長，吸光度增幅緩慢，選水浴時間30～60 min較為合適。

2.3 影響火棘多酚含量測定的單因素考察

參照1.2.5 設計，結果見圖2(A～E)。

參照2.2 的分析，結合圖2(A～C)可知，在用于火棘多酚檢測時，福林酚濃度可調整至0.4 mol/L，Na2CO3溶液濃度可選擇200 g/L，水浴溫度選擇25 ℃，水浴時間60 min 較為合適。由圖2(D)可知，溶液體系的pH 對總酚含量的測定有一定影響，當pH＜3 時，無顯著影響，3＜pH＜5 時，隨pH 增加，吸光度增加，5＜pH＜7 時，隨pH 增加，吸光度減小。考慮到火棘酚類溶液呈酸性，在酸性條件下貯藏穩定，因此只考察酸性條件對檢測的影響。工業化生產時，多酚的提取免不了使用乙醇為溶劑，由圖2(E)可知，待檢體系中乙醇的含量對多酚檢測有一定影響，隨著乙醇濃度的增加，吸光度先增后減，乙醇濃度為40 %時達到極值，進一步增大乙醇濃度超過80 %時，待檢溶液出現渾濁，分析認為是提取液中少量多糖醇沉析出或Na2CO3難溶入乙醇而析出。

圖2 福林酚試劑的濃度(A)、Na2CO3溶液的濃度(B)、水浴時間及溫度(C)、火棘總酚溶液體系pH 值(D)及火棘總酚提取液中乙醇體積濃度(E)對火棘總酚含量測定的影響.Fig.2 Effects of concentration of Folin-Ciocalteu reagent (A)，concentration of Na2CO3(B)，incubation time and temperature(C)，pH of total polyphenols solution from P.fortuneanna (D)and ethanol concentration of extraction solution from P.fortuneana (E)on total polyphenols of P.fortuneana

2.4 響應面優化實驗

按照1.2.6 設計，具體結果參見表2。

表2 Box-Behnken 實驗設計及結果Table 2 Box-Benhnken experimental design and the results

利用Design-Expert 8.0.6 軟件，對表2 結果進行統計分析，得到三元二次回歸方程式:Y=0.30 +0.087 X1+5.25 ×10-3X2+0.013 X3-0.01 X1X2-9.5×10-3X1X3-4.75 ×10-3X2X3-0.07-7.9 ×10-53-9.65 ×10-3利用Design-Expert 8.0.6 軟件，進一步對實驗結果進行統計分析，結果見表3。

表3 方差分析表Table 3 ANOVA of regression analysis

由表3 可知，X1、X3、項對響應值影響極顯著(P＜0.01)，X1X2項影響顯著(0.01＜P＜0.05)。判定系數R2=0.9941 說明模型顯著，相關性非常好，實驗因素對響應值有較大影響。校正判定系數=0.9865，表明98.65%的實驗數據的變異性可以用此回歸模型解釋。變異系數CV=3.26%，說明實驗的可信度及精確度較好。精確度＞4 視為合理，本實驗精密度=31.256，表明符合要求。模型F值為131.30，表明該模型達到極顯著水平(P＜0.01)。此外，失擬項F 值為4.24(P=0.0985 ＞0.05)，說明失擬值和純誤差沒有顯著性關系，回歸模型在被研究的整個回歸區域不失擬，該模型能用于指導實驗。

進一步對模型進行兩因素效應分析，結果見圖3。

由圖3(A)可知，Na2CO3濃度與水浴時間交互作用顯著，吸光度隨Na2CO3濃度的增加呈現先快增后減緩的趨勢，在Na2CO3濃度為145 g/L 左右時達到極值，Na2CO3濃度對吸光度影響顯著。圖3(B)表明水浴時間與水浴溫度交互作用不顯著，相對而言，水浴溫度對吸光度的影響更顯著一些。圖3(C)表明，吸光度隨Na2CO3濃度的增加呈現先快增后減緩的趨勢，在Na2CO3濃度為160 g/L 左右時達到極值，相對而言，Na2CO3濃度對吸光度影響更顯著。

通過軟件(Design Expert 8.0.6)分析得到火棘多酚檢測的最適條件為Na2CO3濃度171 g/L、水浴時間40.43 min，水浴溫度33.97 ℃，在此條件下吸光度的預測值為0.3306。為了驗證該響應面結果的可行性，對所得最佳條件進行了優化和驗證實驗。在Na2CO3濃度170 g/L、水浴時間40 min，水浴溫度34 ℃條件下進行5 次實驗，所得吸光度分別為0.3253、0.3263、0.3243、0.3260、0.334，平均值為0.3277，相對標準偏差為0.495%，說明該條件下實驗結果穩定，與預測值的相對誤差為1.51%，說明該響應面結果可靠。

2.5 測定方法評價

2.5.1 標準曲線關系考察

圖3 火棘多酚含量測定響應面及等高線圖Fig.3 Response surface plots and contour plots for the determination of polyphenols content from P.fortuneana

配制不同濃度(10、15、20、25、30、35 μg/mL)的沒食子酸溶液及火棘總酚提取液(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L)，按以上試驗得出的最適條件顯色后，在765 nm 波長測吸光度，分別以沒食子酸及火棘總酚提取液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標進行線性回歸，分別得到線性回歸方程為:Y=0.00111+0.01682X(R2=0.9983)，Y=0.04482+0.32057xX(R2=0.9965)。結果表明沒食子酸及火棘總酚提取液濃度分別在10～35 μg/mL 以及0.4～1.4 g/L 與吸光度線性關系良好。其中y 為吸光度，x 為濃度。

2.5.2 重復性考察

按已確定的最適條件，取火棘總酚濃度為0.4、1.4 g/L 樣品2 份，由同一分析人員在765 nm 波長處平行測定5 次吸光度，記錄數據，求相對標準偏差RSD(%)，結果見表4。

表4 重復性實驗Table 4 Repeatability tests of the determination results

表5 重現性實驗Table 5 Reproducibility tests of the determination results

由表4 可知，該方法測定2 份樣品的標準偏差分別為0.00158 和0.00235，相對標準偏差為0.90%和0.47%，呈現出良好的重復性。

2.5.3 重現性考察

按已確定的最適條件，取火棘總酚濃度為0.4、1.4 g/L 樣品2 份，由不同實驗室，不同分析人員在765 nm 波長處平行測定5 次吸光度，記錄數據，求相對標準偏差RSD(%)，結果見表5。

由表5 可知，該方法測定2 份樣品的標準偏差分別為0.00230 和0.00239，相對標準偏差為1.33%和0.48%，呈現出良好的重現性。

2.5.4 穩定性考察

按已確定的最適條件，取火棘總酚濃度為0.4、1.4 g/L 樣品2 份，每隔10 min 在765 nm 波長處測定吸光度，連續測定6 次。記錄數據，求相對標準偏差RSD(%)，結果見表6。

表6 穩定性實驗Table 6 Stability tests of the determination results

由表6 可知，該方法測定2 份樣品的標準偏差分別為0.0016 和0.0018，相對標準偏差為0.92%和0.36%，表明樣品在1 h 內檢測穩定。

2.5.5 加標回收率測定

取5 份濃度為0.4 mg/mL 火棘總酚提取液1.0 mL，分別加入沒食子酸0.2 mg，按以上實驗確定的最適條件，測定5 份樣品的吸光度并計算混合后的總酚含量。計算回收率及相對標準偏差，結果見表7。

表7 沒食子酸加樣回收率實驗(n=5)Table 7 Recovery tests of gallic acid (n=5)

由表7 可知，該方法的相對標準偏差僅為0.12%，具有較高的回收率99.95%。

3 結論

通過響應面優化建立了福林酚比色法檢測火棘總酚含量的定量方法。結果表明，火棘總酚的最適檢測條件為:1 mL 適宜濃度的火棘總酚提取物，加入0.4 mol/L 福林酚試劑5 mL，漩渦混勻后，加入170 g/L Na2CO3溶液1 mL，混勻后于34 ℃水浴反應40 min，冰水中快速冷卻，室溫條件下于765 nm波長測吸光度。該方法具有極好的重復性及重現性，1 h 內檢測穩定性高，回收率高達99.95%，測定時雖然待測液體系pH 及乙醇濃度對吸光度有一定的影響，但因為待檢樣品液檢測時都被預先稀釋了很多倍或通過待檢體系得以稀釋，因此可忽略待測液體系pH 及乙醇濃度的影響。該方法可推廣應用于其它植物總酚含量的檢測。

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