刺五加中異嗪皮啶提取工藝優(yōu)化及其抗腫瘤、抗氧化活性研究

汪 琢，姜守剛，郭曉帆，王虹玲，劉 欣

1沈陽工學院生命工程學院，撫順 113122;2東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040

刺五加為五加科植物刺五加的根和根莖，廣泛分布于我國多個省份和地區(qū)，是我國重要的中草藥之一，此外在朝鮮、俄羅斯遠東地區(qū)以及日本北海道等地也有分布和種植［1］。據(jù)《中國藥典》記載，刺五加具有益氣健脾、補腎安神之功效，主要用于脾腎陽虛、體虛乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多夢等病癥［2］。國內(nèi)外對刺五加的藥理作用研究表明，刺五加可增強機體非特異性防御能力，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射損傷及抗疲勞等作用外，還可治療心血管疾病、糖尿病及神經(jīng)衰弱等癥［3］。刺五加的根和莖部分含有多種活性化學成分，異嗪皮啶(Isofaxidin)是刺五加中主要活性成分之一，具有抗炎［4］和抗菌［5］等多種藥理活性，其含量的高低是評價刺五加質(zhì)量優(yōu)劣的指標之一。到目前為止，對異嗪皮啶的研究主要集中在提取工藝和含量測定，系統(tǒng)的藥效學研究并不多見。由于過量掠奪式采挖，甚至毀林開荒，刺五加野生資源遭到嚴重破壞，有些地方瀕臨滅絕，已難滿足市場供應，因此優(yōu)化刺五加中有效成分的提取條件，考察其藥理作用，對人類充分利用刺五加藥材資源具有重要的意義和作用。本實驗從刺五加根莖中提取分離異嗪皮啶，并在此基礎上對異嗪皮啶進行了抗腫瘤以及抗氧化作用研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱，美國SIM 公司;TS-100 倒置顯微鏡，日本Nikon 公司;DL-CJ-2N 生物潔凈工作臺，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;StatFax-3200 酶標儀，美國AWARENESS 公司;1-15K 高速冷凍離心機，德國Sigma 公司;BS110 電子天平，美國Sartorius公司;3102 型電子天平，遼寧龍騰電子有限公司;DK-8D 型電熱恒溫熱水槽，上海森信實驗儀器有限公司;一次性針頭式濾器，美國Pall Life Sciences 公司;Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國Millpore 公司;MDFU32V 超低溫冰箱，日本SANYO 公司;PB-21 pH 計，美國Sartorius 公司;accu-jet 電動移液器，德國Brand公司;吉爾森Gilson 移液器，法國Gilson 公司;LDZX-40BI 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;X-4 數(shù)字顯示顯微熔點測定儀(溫度未較正)，北京泰克儀器有限公司制造;旋光用WZZ-1S 型數(shù)字自動旋光儀，上海浦東物理光學儀器廠;Waters600 半制備液相(Waters2996 二極管陣列)，美國Waters 公司;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;UV-2550 紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 材料

刺五加藥材購于黑龍江省哈爾濱三棵樹藥材市場，經(jīng)東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室聶紹荃教授鑒定為刺五加的干燥根莖，用前粉碎成小塊狀;昆明種小鼠，雄性18～22 g(動物合格證書編號為20090106)，由哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院提供;荷肉瘤S-180 小鼠，由哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院傳代培養(yǎng);人宮頸癌Hela 細胞、肺癌A549 細胞和前列腺癌PC-3 細胞購于哈爾濱醫(yī)科大學。

2 試驗方法

2.1 異嗪皮啶的提取工藝

刺五加中異嗪皮啶以游離型和結(jié)合型兩種形式存在，結(jié)合型異嗪皮啶以刺五加苷B1 的形式存在，通過酸水解的方法可以得到刺五加中總異嗪皮啶。稱取一定量的刺五加粉末，過60 目篩，加適當?shù)囊掖既軇┖鸵欢舛鹊牧蛩徇M行回流提取，所得提取液經(jīng)過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得總浸膏。總浸膏加10 倍量水在沸水浴中回流制備成混懸液，定量轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加等量氯仿萃取4 次，合并氯仿層萃取液，減壓濃縮干燥，浸膏加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試液［6］。

2.2 分析方法

2.2.1 對照品溶液的制備

取異秦皮啶對照品約5 mg，精密稱定，加甲醇制成50 μg/mL 的對照品貯備溶液［7］。

2.2.2 高效液相色譜測定條件

色譜柱為Zorbax Extrend C18(416 mm × 250 mm，5 μm);流動相:乙腈-甲醇-水-冰醋酸=17∶3∶80∶1;檢測波長344 nm;流速0.9 mL/min;進樣量20 μL，柱溫為室溫。

2.2.3 線性關系考察

取異嗪皮啶對照品貯備溶液(50 μg/mL)，精密吸取0.5、1、2、4、6 mL，加甲醇制成每1 mL 分別含0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0300 mg 異嗪皮啶對照品的溶液，作為各對照品溶液。分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，測定。以異秦皮啶微克數(shù)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得出回歸方程Y=28738X-378240，R2=0.9991。結(jié)果表明異秦皮啶在0.025～0.300 mg 范圍內(nèi)與峰面積積分值成良好線性關系。

2.2.4 異嗪皮啶含量的測定

精密吸取供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，每樣品重復進樣3 次，按外標法計算供試品中異秦皮啶的含量。

2.3 響應面法優(yōu)化刺五加中異嗪皮啶提取工藝試驗

通過參考相關文獻和預實驗，選取固液比、乙醇濃度、提取時間和硫酸濃度為考察因素，以異嗪皮啶提取率為考察指標，設計響應面試驗，利用Minitab15 軟件進行Box-Behnken 設計和數(shù)據(jù)處理，以確定最優(yōu)工藝條件。試驗因素和水平安排見表1。

2.4 異嗪皮啶抗氧化活性實驗

2.4.1 異嗪皮啶抗脂質(zhì)過氧化能力的測定

取1 mL 大豆卵磷脂溶液、1 mL 0.4 mol/L Fe-SO4溶液、1 mL 異嗪皮啶溶液依次加入試管中，混勻。避光于37 ℃水浴60 min，加入2 mL TCA-TBAHCl 混合液(15 g TCA，0.37 g TBA，2.1 mL 濃鹽酸，定容至100 mL)，90～100 ℃水浴15 min，迅速冷卻，以3000 rpm 離心10 min，以蒸餾水為陰性對照，取上清液在535 nm 波長處測定吸光度(As)［8］。抑制率計算公式如下:抑制率(%)=(Ac-As)/Ac×100，式中:As 為樣品的吸光度;Ac 為不含樣品的吸光度。

表1 響應面分析的因子和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2.4.2 異嗪皮啶對超氧陰離子自由基的清除作用

用鄰苯三酚自氧化法測定清除超氧陰離子自由基的能力。取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 8.2)，4.2 mL 蒸餾水，混勻后于25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入0.3 mL 3 mmol/L 鄰苯三酚(以10 mmol/L HCl 配制，25 ℃水浴預熱)，迅速混勻后立即倒入比色皿，(注:空白管以10 mmol/L HCl 代替3 mmol/L 鄰苯三酚)在319 nm 波長下測定吸光度值Ai。加入不同濃度的樣品，再按上述方法依次加入其它試劑，用蒸餾水定容至1 mL，進行測量，按公式P(%)=(A0-Ai)/A0×100［11］計算試液清除率。以相同濃度的維生素C 為陽性對照，每個樣品重復測定3 次。

2.5 異嗪皮啶抗腫瘤活性實驗

2.5.1 MTT 法檢測異嗪皮啶對3 種人癌細胞增殖的體外抑制作用

分別取處于指數(shù)生長期的A549、PC-3、Hela 細胞，用含有10%胎牛血清的RPM I1640 培養(yǎng)液稀釋成20000 個細胞/mL，96 孔板每孔中加入200 μL 細胞懸液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將異嗪皮啶用一定濃度的DMSO 溶解，每孔中加入設定濃度異嗪皮啶，稀釋至需要的工作濃度。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。MTT 用PBS 配成5 mg/mL 溶液，每孔中加入20μL，置于37 ℃，5%CO2孵箱中孵育4 h。吸出上清液，用PBS 洗3 次，加入150 μL DMSO 溶解沉淀物，用振蕩器搖勻，酶標儀測定其OD 值。計算藥物對腫瘤細胞的抑制率:腫瘤細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%

2.5.2 異嗪皮啶對小鼠實體瘤S180的抑制作用

取生長旺盛的S180腹水瘤小鼠，無菌抽取腹水，用生理鹽水(1∶6)稀釋，制成細胞懸浮液，取0.1 mL于玻璃片上，加0.02%臺朌藍1 滴，在光鏡下計數(shù)，活細胞數(shù)應大于95%。取此腫瘤細胞懸液，無菌條件下接種于昆明種小鼠右腋下，每只0.2 mL，然后隨機分組。取小鼠80 只，按上述方法造模后，隨機分為4 組，分別為陽性對照組，異嗪皮啶和環(huán)磷酰胺組，異嗪皮啶高劑量組、異嗪皮啶低劑量組和空白對照組。連續(xù)小鼠尾靜脈注射給藥7 d，末次給藥后次日處死動物，解剖取瘤，稱重，并進行統(tǒng)計學(t 檢驗)處理，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-實驗組平均瘤重/模型對照組平均瘤重)×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 響應面法設計試驗結(jié)果

以異嗪皮啶的含量為響應值，經(jīng)回歸擬合后，得試驗結(jié)果見表2，根據(jù)Box-Behnken 設計分析，各實驗模型均顯著，同時，失擬情況均為不顯著，這表明試驗所模擬的模型可用，當P 值小于0.05 時表明該模型項為顯著因素，因此，通過表3 可知，對異嗪皮啶的含量影響顯著的因素有:一次項A、B 和二次項A2、B2 和C2，其中硫酸濃度和固液比對異嗪皮啶含量影響顯著。運用Minitab 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件使用未編碼單位對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表4，得到硫酸濃度、固液比、乙醇體積分數(shù)和提取時間的二次多項回歸模型:Y=31.5167 +0.94A +0.46B-2.76A2-1.89B2-1.54C2+0.56AB+0.69BC。

將建立回歸模型中的C、D 兩因素固定在零水平，得到另外A、B 兩因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應面及其等高線見圖1。因子的交互作用效應可以從響應曲面的坡度變化及等高線的形狀得到反映，響應曲面坡度的平緩與陡峭程度，表明在處理條件發(fā)生變異時提取率的響應靈敏程度，如果響應曲面坡度相對平緩，表明異嗪皮啶提取率可以忍受處理條件的變異，響應值不敏感;反之，如果響應曲面坡度非常陡峭，表明對于處理條件的變異，響應值非常敏感，等高線的形狀為橢圓形，表示兩因素交互作用顯著;為圓形則表示兩因素交互作用可忽略不計。

等高線表示在同一橢圓形區(qū)域里，提取率是相同的，在橢圓形區(qū)域中心，提取率最大，并逐漸向邊緣減少。圖中橢圓排列越密集，表明因素的變化對酶解率的影響越大。圖1 反映出提取率在各因素的中心點附近可獲得最大值。

根據(jù)軟件分析結(jié)果，對試驗結(jié)果進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件:硫酸濃度為11.5%，固液比為1∶8，乙醇體積分數(shù)為50%，提取時間為30 min，在此條件下，依照2.1 的提取方法處理提取液，經(jīng)高效液相色譜檢測后，可得刺五加中總異嗪皮啶含量為29.5 μg/g。

3.2 最佳條件驗證試驗

按以上對Minitab 軟件分析得到的最優(yōu)的響應值，在最優(yōu)的條件下進行三組平行試驗，驗證試驗結(jié)果。異嗪皮啶的含量為(29.34 ±0.1)μg/g，與理論值(29.5 μg/g)相差0.54%，證實了模型的有效性。

表2 Box-Behnken 實驗設計方案及實驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken designs and results

表3 回歸方程偏回歸系數(shù)的估計值Table 3 Estimated values of the partial regression coefficients of the regression model

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

3.3 異嗪皮啶抗氧化活性實驗結(jié)果

3.3.1 異嗪皮啶抗脂質(zhì)過氧化

卵磷脂可被·O H 氧化損傷產(chǎn)生丙二醛(MDA)類似物，硫代巴比妥酸(TBA)可與MDA 類似物反應生成粉紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在532 nm 處有最大光吸收［9］。通過測定加有異嗪皮啶的待測液在532 nm 吸光度值，即可檢測異嗪皮啶的抗脂質(zhì)過氧化能力［10］。表5 結(jié)果表明，異嗪皮啶對脂質(zhì)過氧化具有一定的抑制作用。在濃度為1 mg/mL 時，抑制率為23.15%，其抑制作用與0.2 mg/mL 維生素C一致。

3.3.2 異嗪皮啶清除超氧陰離子自由基作用

圖3 為不同濃度異嗪皮啶對超氧陰離子自由基的清除作用，由圖3 可知，不同濃度的異嗪皮啶具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，并隨著濃度的增加，清除率不斷提高。當陽性對照維生素C 的濃度為0.2 mg/mL 的時候，維生素C 的清除率可以達到75.16%，與維生素C 相比，異嗪皮啶的清除超氧陰離子自由基的能力不及維生素C，但也具有一定的清除能力。

圖1 硫酸濃度和液固比對異嗪皮啶含量影響的響應面及等高線Fig.1 Response surface plot and contour plot showing the effects of concentration of sulfuric acid and solid-liquid ratio on yield of isofaxidin

表5 異嗪皮啶對脂質(zhì)過氧化的抑制率Table 5 Inhibitory effects of isofaxidin on lipid peroxidation

圖3 不同濃度異嗪皮啶對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 Radical scavenging activity of isofaxidin against superoxide

3.4 異嗪皮啶的體內(nèi)外抗腫瘤活性

3.4.1 MTT 法檢測異嗪皮啶對3 種人癌細胞增殖的體外抑制作用

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，由OD 值計算生長抑制率，將抑制率與藥物濃度做圖，得出劑量反應曲線，計算出IC50(半數(shù)抑制濃度)值。MTT 檢測結(jié)果表明異嗪皮啶對3 種腫瘤細胞均有一定的抑制作用，隨著異嗪皮啶濃度的增大腫瘤抑制率也升高，呈明顯的劑量依賴性(見圖4)。對3 種腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值見表6。

圖4 異嗪皮啶對3 種腫瘤細胞株的生長抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of isofadixin on the growth of three cell lines

表6 異嗪皮啶對3 種腫瘤細胞株的IC50值Table 6 IC50values of the three cell lines treated with isofaxidin

3.4.2 異嗪皮啶對小鼠實體瘤S180的抑制作用

異嗪皮啶對小鼠實體瘤的抑制作用結(jié)果如表7所示。表7 結(jié)果表明，異嗪皮啶和環(huán)磷酰胺聯(lián)合給藥組S180小鼠平均瘤重均明顯低于生理鹽水組、異嗪皮啶單獨給藥組以及環(huán)磷酰胺單獨給藥組，抑瘤率分別為69.20%、20.54%以及66.07%，由此表明異嗪皮啶對小鼠腹水瘤發(fā)病具有一定干預作用，適用作抗癌藥物輔助藥品。

4 討論

通過響應面試驗方法確定了從刺五加中提取異嗪皮啶的最佳工藝為硫酸濃度為11.5%，固液比為1∶8，乙醇體積分數(shù)為50%，提取時間為30 min，在此條件下，異嗪皮啶的提取率為29.5 μg/g;另外，對異嗪皮啶的抗氧化活性進行評價，異嗪皮啶的抗脂質(zhì)過氧化能力試驗表明，異嗪皮啶對脂質(zhì)過氧化具有一定的抑制作用，在濃度為1 mg/mL 時，抑制率為23.15%，其抑制作用與0.2 mg/mL 維生素C相當;異嗪皮啶對超氧陰離子自由基的清除作用試驗表明，不同濃度的異嗪皮啶具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，并隨著濃度的增加，清除率不斷提高。但是與0.2 mg/mL 維生素C 的清除率相比，異嗪皮啶的清除超氧陰離子自由基的能力偏弱，但也具有一定的清除能力。此外，對異嗪皮啶的抗腫瘤效果的評價從體內(nèi)和體外兩個方面進行。本試驗采用MTT 法，選用人宮頸癌Hela 細胞、肺癌A549細胞和前列腺癌PC-3 細胞進行抗腫瘤實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異嗪皮啶對上述3 種腫瘤細胞均有一定的抗腫瘤活性，IC50值分別為108.89、94.05、31.60 μg/mL，均呈明顯的量-效關系。另外，荷瘤小鼠實驗表明，異嗪皮啶對實體瘤的生長具有一定的抑制作用，但是弱于異嗪皮啶和環(huán)磷酰胺聯(lián)合給藥組和環(huán)磷酰胺單獨給藥組，抑瘤率分別為20.54%、69.20% 以及66.07%。我國刺五加資源豐富，但目前主要使用刺五加混合物成分，本文對異嗪皮啶的抗氧化和抗腫瘤活性進行研究，在開發(fā)美容產(chǎn)品和抗腫瘤藥物的同時，更充分利用了刺五加藥材資源，為進一步開發(fā)利用刺五加的藥用價值提供參考。

表7 異嗪皮啶對S180荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用Table 7 Inhibitory rate of Isofadixin by calculating S180tumor weight in mice

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