響應面法優化杜香多糖提取工藝

張喬會，逄錦慧，楊 喆，王建中

北京林業大學 北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083

杜香(Ledum palustre L.)為杜鵑花科杜香屬的常綠灌木［1］，是我國東北、內蒙古大興安嶺林區的主要森林組成樹種，其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%［2］。大興安嶺杜香干葉年生產量達536925 t/a，小興安嶺杜香的蘊藏量可達8776.7 t/hm2·a，其中允收量以鮮重計為1843.2 t/hm2·a［3］。杜香枝葉含有多種揮發性成分［4］、黃酮類成分、香豆素類成分等。具有抗菌消炎、透皮吸收、驅蟲、抗輻射等作用［5-7］?？梢灾谱黩屜x劑、保健品、日用品［8］、藥品等，在食品、保健品、化妝品及醫藥等領域具有廣泛的應用前景。

杜香多糖的提取目前鮮見報道，但作為天然的植物多糖，具有廣譜化學結構和生物功能。多糖的提取可采用水提取法、中性鹽溶液提取法、堿提取法、蛋白酶水解提取法等［9］。其中水作溶劑是提取植物中多糖的常用方法。植物源多糖常具有提高人體免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗凝血、抗炎等生理活性［10-12］，還有抑制脂類氧化、穩定蛋白等作用［13，14］。本文以杜香為原料采用水提醇沉法提取多糖，利用紅外和紫外光譜分析多糖特征基團及含量，并用響應面法對提取工藝進行優化，得到最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

HHS4-型恒溫水浴鍋:上海浦東躍新科學儀器廠;KQ-500E 型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;QI-901 渦旋混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;臺式離心機:上海安亭科學儀器廠;RE-5203 旋轉蒸發儀:上海亞榮生化儀器廠;METTLER TOLEDO-電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;冷凍干燥機FD-1:北京德天佑科技發展有限公司;T6 紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責任公司;Tensor27 型FT-IR 紅外光譜儀:德國Bruker 公司。

1.2 試劑及材料

無水乙醇、去離子水、石油醚、濃硫酸、蒽酮、葡萄糖等，所有試劑均為分析純。杜香(由內蒙古金河林業局2013 年7 月中旬采集提供，由北京林業大學植物專家堅定為杜香)。

1.3 試驗方法

1.3.1 試樣的制備

將杜香枝葉切分成2～3 cm 的小段后于40 ℃烘箱中烘干，然后用粉碎機粉碎，過20、40、60、80、100 目篩，存于室內陰涼干燥處備用。

1.3.2 杜香多糖提取工藝

采用水提醇沉法。準確稱取一定量的杜香枝葉粉，按一定比例加入去離子水，放入恒溫水浴震蕩箱中震蕩一定時間，離心分離液體和固體粉末，向上清液體中加入酒精至濃度為85%，放置于4 ℃冰箱中靜置1 h，分離固液兩相，固體為粗多糖。將上一步得到的樣品加入一定量的石油醚處理一定時間進行脫脂，接著將上一步得到的固相溶解于一定量的去離子水中，加入酒精至濃度為85%，放置于4 ℃冰箱中靜置1 h，然后分離固液兩相，重復上述操作4次，冷凍干燥，便可得到杜香多糖成品。

1.3.3 杜香多糖定性檢測

在4000～400 cm-1波長范圍內對水提醇沉得到的杜香多糖進行紅外檢測，測定分辨率為2 cm-1。

1.3.4 得率計算

按以下公式計算提取得率:

式中P-得率;m-提取得到的杜香多糖的干重;W-杜香枝葉粉末的重量。

1.3.5 粗提物中多糖含量測定

杜香多糖粗提物多糖含量的測定采用蒽酮硫酸法，并以葡萄為參照作標準曲線。

1.3.5.1 標準曲線測定

精密稱取105 ℃下干燥恒重的分析純葡萄糖0.05 g，置于小燒杯中，加去離子水溶解并轉移至1000 mL 容量瓶中，搖勻，配制成濃度為0.05 mg/mL 葡萄糖標準溶液。準確移取濃度為0.05 mg/mL葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 于10 mL 比色管中，加蒸餾水補足至1 mL。在冰水浴中加入0.1%蒽酮硫酸溶液4 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱15 min 后取出，自來水冷卻至室溫并放置10 min，以蒸餾水代替樣液作空白，在最580 nm 處讀取吸光度。以葡萄糖含量為縱坐標、吸光度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.5.2 杜香多糖含量的測定

準確稱取提取的杜香多糖0.03 g，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.3 mg/mL 的杜香多糖貯備液。將杜香多糖貯備液稀釋10 倍后，取1 mL 按1.3.5.1 方法測定杜香多糖貯備液的吸光度，根據標準曲線方程求出此杜香多糖貯備液中含量，從而計算出杜香多糖粗提物中多糖的含量。

1.3.6 杜香多糖提取的單因素試驗設計

分別以不同的提取溫度、時間、物料粒度及液料比為單因素，考察各因素對杜香多糖提取得率的影響。

1.3.6.1 物料粒度

設定料液比1∶20，提取溫度60 ℃，提取時間2 h，考察物料粒度分別為20、40、60、80、100 目時對多糖提取得率的影響。

1.3.6.2 料液比

設定物料粒度40 目，提取溫度60 ℃，提取時間2 h，考察料液比分別為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1∶30、1∶35(m/v)時對多糖提取得率的影響。

1.3.6.3 提取時間

設定物料粒度40 目，料液比1∶20，提取溫度60℃，考察提取時間分別為1、2、3、4、5 h 時對多糖提取得率的影響。

1.3.6.4 提取溫度

設定物料粒度40 目，料液比1∶20，提取時間2 h，考察提取溫度分別為20、40、60、80、100 ℃時對多糖提取得率的影響。

1.3.7 杜香多糖提取工藝的試驗設計

在單因素試驗的基礎上，運用Design expert 7.1軟件程序，根據Box-Behnken 中心組合實驗設計原理［5，15］，采用四因素三水平的響應面分析法，以提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、物料粒度(D)為自變量，以杜香多糖的提取率為響應值，通過響應曲面分析(response surface analysis，RSA)對提取條件進行優化。

表1 響應面試驗因素水平設計表Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2 結果與分析

2.1 杜香多糖紅外檢測結果

杜香多糖紅外譜圖在3389、1156-1024、1024、2889 cm-1的尖峰以及1567～1370、1648、1648、903 cm-1等處具有強弱不同的吸收峰。在3389 cm-1和1156～1024 cm-1的峰分別為O-H 和C-O 的伸縮振動，1024 cm-1的較強吸收也說明了杜香多糖中可能有葡萄糖結構，2889 cm-1的尖峰以及1567～1370 cm-1的不太尖的峰分別為C-H 的伸縮振動和變角振動，1648 cm-1處出現吸收峰，推測該峰為醛基中C=O 的伸縮振動引起的，譜圖在1648 cm-1波數處還出現一個較強的吸收峰，說明杜香多糖中可能有酰氨取代基，譜圖在903 cm-1波數處還出現吸收峰，說明杜香多糖可能含有β-型糖苷鍵。總之，杜香水提醇沉物具有多糖的一般吸收峰，證明杜香水提醇沉物為杜香多糖。

2.2 杜香多糖粗提物中多糖含量測定結果

在葡萄糖含量為0.000～0.100 mg/mL 的范圍內，葡萄糖含量與吸光度線性關系良好。經線性回歸，標準曲線方程為y=9.790x-0.002，回歸系數R2=0.9955。測得杜香粗提物的吸光值為0.272，從而計算出杜香多糖粗提物中多糖的含量為92.6%。

2.3 杜香多糖提取單因素實驗結果

從圖1-A 可以看出，在提取時間、提取溫度、料液比一定的時候，材料粒度的大小對杜香多糖的提取得率的影響呈正相關。物料越細，提取得率越大，且隨著物料目數的增大，杜香多糖的提取得率以穩定的趨勢上升。但由于將物料粉碎過細會影響下一步分離，且能耗大不環保，故只考慮至100 目。

從圖1-B 看出，料液比從1∶10 增加到1∶20時，杜香多糖提取得率穩步上升，可能是因為隨著料液比增大，目的提取物會更易溶于提取溶劑中;料液比在1∶20 至1∶30 之間時，提取得率增加變緩，可能是因為一定比例的溶劑已經將有效成分大部分溶出;料液比在1∶30 至1∶35 之間時，提取得率受到的影響不大，可能是由于足夠的溶劑已經將多糖全部溶解，再加大料液比會使雜質更多溶出，從而造成多糖提取得率下降。因此選擇1∶30 作為優選料液比。

圖1 物料粒度(A)、料液比(B)、時間(C)、溫度(D)對杜香多糖提取得率的影響Fig.1 Effects of particle size of Ledum (A)，solid:liquid ratio (B)，time(C)，temperature(D)on extraction yield of Ledum polysaccharide

從圖1-C 可以看出，提取時長4 h 以內，隨著提取時間的增加，杜香多糖的提取得率逐漸增大，但提取2 h 后提取得率增加逐漸減緩。提取4 h 后，提取得率隨時間基本沒有變化，可能是物料中能溶解的多糖已經基本溶出。因此確定優選提取時間為4 h。

從圖1-D 可以看出，溫度的高低對杜香多糖的提取有較大的影響。隨著溫度的升高，提取得率增大，當溫度達到80 ℃時提取得率最大，之后提取得率隨溫度的增加基本沒有變化。所以確定優選提取溫度為80 ℃。

2.4 響應面模型的建立及結果

2.4.1 響應面模型回歸分析

以A(提取溫度)、B(提取時間)、C(料液比)、D(物料粒度)為變量，以杜香多糖的提取得率為響應值，按響應面軟件Design expert 7.1 提供設計的組合進行試驗，得到結果見表2。

表2 響應面分析的試驗結果Table 2 Program and experimental results of RSA

采用Design expert 7.1 軟件程序對試驗數據進行回歸分析，得出杜香多糖提取得率的回歸方程如下:Y=0.38 +1.925E-003 ×A +8.483E-003 ×B +4.317E-003 × C+0.10 × D-5.000E-005 × AB -5.150E-003 ×AC +6.575E-003 ×AD +3.300E-003×BC+7.900E-003 ×BD +5.500E-004 ×CD-0.017×A2-1.912E-003 ×B2-1.038E-003 ×C2-0.089 ×D2。

其決定系數R2=0.9952，說明回歸方程適用于提取杜香多糖的理論預測值。對回歸方程做顯著性檢驗與方差分析，結果見表3。

表3 二次響應面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

2.4.2 響應面與等高線

根據回歸方程，作出響應面和等高線圖，考察擬合響應曲面的形狀，分提取溫度、提取時間、料液比和物料粒度對杜香多糖提取得率的影響，如圖2～7所示。等高線的形狀可以反映出交互相的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反［16］。由二次響應面回歸模型方差分析可知，物料粒度對杜香多糖提取得率的影響最大，提取溫度、液料比、提取時間的影響相對小一些，具體為:物料粒度(D)＞提取溫度(A)＞液料比(B)＞提取時間(C)。即達到一定的料液比和提取間后，料液比和提取時間對提取得率的影響十分微小。

圖2 Y=f (A，B)的響應面與等高線Fig.2 Response surface plot and contour plot of Y=f (A，B)

圖3 Y=f (A，C)的響應面與等高線Fig.3 Response surface plot and contour plot of Y=f (A，C)

圖4 Y=f (A，D)的響應面與等高線Fig.5 Response surface plot and contour plot of Y=f (A，D)

圖5 Y=f (B，C)的響應面與等高線Fig.5 Response surface plot and contour plot of Y=f (B，C)

圖6 Y=f (B，D)的響應面與等高線Fig.6 Response surface plot and contour plot of Y=f (B，D)

圖7 Y=f (C，D)的響應面與等高線Fig.7 Response surface plot and contour plot of Y=f (C，D)

2.4.3 優化提取工藝條件的確定

為進一步確定最佳點，利用Design expert7.1 軟件程序對工藝條件進行優化，可得杜香多糖提取得率的最佳方案為:提取溫度為80.43 ℃，提取時間為6 h，液料比為35∶1(mL/g)，物料粒度為84.55 目。在此工藝條件下，軟件程序對杜香多糖提取得率的預測值為4.26%。為了實際的操作方便，將杜香多糖的提取工藝參數修正為:提取溫度為80 ℃，提取時間為6 h，料液比為1∶35(m/v)，物料粒度為80目，在此條件下實際測得的平均提取得率為4.19%，與理論預測值相比相對誤差約為1.64%。因此采用修正后的方法得到的提取參數準確可靠，具有實用價值。

3 結論

以杜香枝葉粉末為原料，以水為溶劑提取杜香多糖，主要受物料粒度和提取溫度的影響。提取時間和料液比達到一定程度后對提取得率的影響不大。利用響應面法對杜香多糖的提取工藝進行了優化。得到的水提杜香多糖的優化工藝條件為提取溫度為80 ℃，提取時間為6 h，料液比為1∶35(m/v)，物料粒度為80 目，在此條件下杜香多糖的提取得率可達4.19%。

1 China Flora Editorial Board of CAS(中國科學院中國植物志編輯委員會).Flora of China(中國植物志)，Beijing:Scientific Publishing House，2005.

2 Feng X(馮旭)，Zhou Y(周勇)，Guo LX(郭立新).Wild perfume plant resources and its utilization in Heilongjiang.Terri Nat Res(國土與自然資源研究)，1995，2:68-72.

3 Zhou LL(周以良).The Vegetation of Chinese Greater Khingan Range(中國大興安嶺植被)，Beijing:Scientific Publishing House，1991.239.

4 Wang Y(王炎)，Zhao M(趙敏).Study on volatile components of Ledum palustre L from Greater Khingan Rangearea.Chin J Chromatogr(色譜)，2003，6:631-632.

5 Fu HT(付海田)，Deng C(鄧超)，Wang M(王敏)，et al.Extraction，structural identification and bioactivities of polysaccharide from fermented Cordyceps.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2014，26:111-116.

6 Yan XZ(嚴宣佐)，Zhou Y(周勇)，Tao JD(陶君銻).Experimental study on the development and utilization of Ledum-Experimental study on anti fungus and bacteria by Ledum oil.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，1993，1:7-9.

7 Xiao HQ(肖懷秋)，Li YZ(李玉珍).Extraction and antioxidation of polysaccharides from Lygodium japonicum(Thumb)Sw.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2012，24:105-109.

8 Liu QH(劉慶華)，Fan HY(范慧穎).Preparation and application of compound Ledum anti-inflammatory Lotion.J Sci Teachers Coll Univ(高師理科學刊)，2007，6:53-56.

9 Shi L(史霖)，Gong CR(宮長榮)，Wu LL(毋麗麗)，et al.The development of extraction，isolation and application of plants polysaccharides.Chin Agric Sci Bull(中國農學通報)，2007，9:192-195.

10 Zhang YH(張英慧)，Qu AQ(曲愛琴)，Song JQ(宋劍秋)，et al.Effect of fucoidan-galactosan sulfate from Laminaria japonica on the cytotoxicity of murine peritoneal macrophages.Immunol J(免疫學雜志)，2002，5:403-404.

11 Xu GH(徐國華)，Han ZH(韓志紅)，Wu YF(吳永方)，et al.Inhibitory effect of pumpkin polysaccharide and its effect on immune function of red blood cell.J Wuhan Pro Med Coll(武漢市職工醫學院學報)，2000，4:8-11

12 Haysahi T，Haysahi K.Calcium Spirulina，an inhibitor of enveloped virus replication，from a blue-green algae Spirulina.Nat Prod，1966，1:83-87.

13 Matsumura Y，Egami M，Satake C，et al.Inhibitory effects of peptide bound polysaccharides on lipid oxidation in emulsions.Food Chem，2003，1:107-119.

14 Nakamura A，Furuta H，Kato M，et al.Effect of soybean soluble polysaccharides on the stability of milk protein under acidic conditions.Food Hydrocolloids，2003，3:333-343.

15 Gu X(顧欣)，Li L(李莉)，Hou YK(侯雅坤)，et al.Optimization on extraction of protein from apricot(Armeniaca sibirica)kernel via response surface analysis.Heibei J Forest Orchard Res(河北林果科技)，2010，6:162-168.

16 Yi JP(易軍鵬)，Zhu WX(朱文學)，Ma HL(馬海樂)，et al.Optimization on ultrasonic-assisted extraction technology of oil from Paeonia suffruticosa Andr.seeds with response surface analysis.Trans Chin Soc Agric Mach(農業機械學報)，2009，6:103-110.