HPLC 同時測定延胡索中6 個核苷成分含量

陳東東，陳亞運，周 萍，李 祥，陳建偉

南京中醫藥大學，南京 210023

延胡索來源于罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang 的干燥塊莖，是著名的“浙八味”中的一種。始載于《神農本草經》，列為中品，味辛、苦，性溫。具有活血，利氣，止痛等功效，用于治療胸肋、脘腹疼痛，經閉痛經，產后瘀阻，跌撲腫痛［1］等癥。本品為中國藥典所載常用中藥，全國多地區有分布，主產于江蘇、浙江等地。現代研究發現，延胡索對心血管系統、神經系統等藥理作用明顯，臨床應用較為廣泛，用量較大。核苷是生物細胞維持生命活動的基本組成元素，參與DNA 代謝過程，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性［2］。如腺苷具有改善心腦血液循環，防止心律失常，抑制神經遞質釋放和調節腺苷酸環化酶活性等［3，4］。目前在延胡索質量評價方面，大多以延胡索乙素等生物堿的含量為指標，而關于核苷類成分的含量測定，筆者尚未見到相關文獻報道。本實驗通過參照其他有關核苷成分含量測定的相關報道，對延胡索中6 種核苷成分進行了定性、定量分析，為延胡索的化學成分、藥理作用，和多指標質量控制提供了科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀:包括Waters2489型PDA 檢測器，Empower 工作站(Waters 公司);AG285 電子天平(瑞士Mettler Toledo 公司);KQ-2200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);純水儀(南京易普易達科技發展有限公司)。

1.2 試藥

對照品胞苷(批號0001446223)、尿苷(批號100469-200401)、腺苷(批號140709-200602)、2-脫氧腺苷(批號20331-201208)、鳥苷(批號20332-201205)、胸苷(批號140661-200301)購自Sigma 公司;三批延胡索購自江蘇宜興、江蘇南通、浙江杭州，經本校中藥資源教研室陳建偉教授鑒定為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang 干燥塊莖;甲醇、磷酸為北京化工廠產品;水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Grace Prevail C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱;以甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫為:(0～15min，0.5%～7%甲醇;15～25min，7%～15%甲醇;25～35min，15%～80% 甲醇;35～45min，80%～90%甲醇);流速0.8 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長260 nm;進樣量均為10 μL。

2.2 對照品和供試品溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液

精密稱取胞苷、尿苷、腺苷、2-脫氧腺苷、鳥苷、胸苷的對照品適量，用10%的甲醇溶液配制成質量濃度分別為607.3、908.4、967.6、210.6、679.7、256.3 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

延胡索研成粉末，過60 目篩，精密稱取1.0 g，置50 mL 錐形瓶中，精密量取10%甲醇10 mL，稱定重量，超聲(500 W，40 kHz)處理30 min，冷卻至室溫，稱重，用10%甲醇補足減失重量，過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性實驗

在“2.1”項色譜條件下，混合對照品溶液和延胡索供試品溶液的色譜圖見圖1，混合對照品溶液及延胡索供試品溶液中6 種核苷達到基線分離。

圖1 混合對照品(A)和供試品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and C.yanhusuo sample (B)

2.3.2 線性關系考察

分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 至10 mL 容量瓶中，加10%甲醇定容至刻度，離心后取10 μL 注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行分析，以峰面積Y 對進樣量X 進行回歸計算，回歸方程見表2。

表1 被測核苷的線性關系和線性范圍Table 1 Linear ranges and regression equations of studied nucleosides

2.3.3 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別連續進樣測定6 次，測定6 種核苷的峰面積并計算其RSD。結果顯示胞苷、尿苷、腺苷、2-脫氧腺苷、鳥苷、胸苷的RSD 分別為1.2%、0.5%、0.6%、1.0%、1.3%、0.8%，符合精密度要求。

2.3.4 穩定性試驗

取同一供試品(浙江杭州)溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20 h 進樣10 μL，測定6 種核苷的峰面積并計算RSD。結果顯示胞苷、尿苷、腺苷、2-脫氧腺苷、鳥苷、胸苷的RSD 分別為0.9%、1.4%、1.6%、1.2%、1.8%、1.3%，表明供試品溶液在20 h 內穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗

取同一批次(浙江杭州)樣品6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算含量及RSD。結果胞苷、尿苷、腺苷、2-脫氧腺苷、鳥苷、胸苷的平均含量分別為21.36、207.85、222.35、8.45、154.83、11.54 μg/g，RSD 分別為1.3%、1.7%、0.9%、1.8%、1.0%、1.2%，表明方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品(浙江杭州)1.0 g 共6 份，按1:1 的比例加入適量對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下方法進樣分析，根據測得量和加入量計算其回收率，結果見表3。

表3 樣品加樣回收率試驗(n=6)Table 3 Results of recovery tests(n=6)

2.4 樣品含量測定

取不同產地延胡索粉末1.0 g，平行3 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下方法進樣分析，采用外標法計算含量，取3 份平均值，結果見表4。

表4 樣品中6 種核苷的含量(n=3，μg/g)Table 4 Contents of six compounds in samples (n=3，μg/g)

3 討論

3.1 提取方法的選擇

通過查閱相關文獻［5-7］，分別對延胡索樣品提取的方法包括超聲提取和加熱回流提取、提取溶劑分別考察了20%甲醇、15%甲醇、10%甲醇、水，提取溶劑的用量分別考察了10、20、40、80 mL 和提取時間20、30、50、60、90 min，等因素進行了考察。結果顯示熱回流和超聲所得供試品中差異不大，但超聲更加簡捷，快速，容易制得，故選擇超聲的提取方法，另外提取溶劑中發現10%甲醇提取的效果較好，幾種核苷成分的含量較高，并同時確定了提取時間30 min 較適宜，料液比1∶10 為最佳提取條件。

3.2 色譜條件的優化

核苷類成分大多溶于水，偏堿性，所以流動相的條件著重考慮了甲醇-水［8］，乙腈-水［9］，甲醇-酸水［10］系統，最后試驗發現選用甲醇-0.1%的磷酸水為流動相時的峰形較好，分離度較高。另外，并對樣品做全波長掃描，發現樣品在254 nm 和267 nm 處有最大吸收，參照相關文獻發現大多在260 nm 處測定核苷成分的含量，發現在260 nm 處，延胡索中6種核苷也都有較好的吸收，峰形較好，分離度較高，故選擇260 nm 作為檢測波長值。

3.3 不同產地延胡索中核苷含量的差異

從表4 中可看出南通、宜興、浙江三個產地中，腺苷和尿苷的含量較高，且遠高于其他4 種，其中又以腺苷含量居首，而2-脫氧腺苷的含量為最低。造成不同核苷成分的含量的差異可能跟當地氣候條件，土壤情況，以及采收時期有關，值得深入研究，以便能更好了解延胡索化學成分的差異，更好的控制延胡索質量。

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