血清m icroRNA?152和m icroRNA?602檢測在肝癌診斷及手術療效評估中的應用

周軼冰

（佳木斯市中心醫院普外科，黑龍江佳木斯154002）

doi：10.3969/j.issn.1672－5565.2015.03.08

血清m icroRNA?152和m icroRNA?602檢測在肝癌診斷及手術療效評估中的應用

周軼冰

（佳木斯市中心醫院普外科，黑龍江佳木斯154002）

為探討microRNA?152和microRNA?602檢測在肝癌診斷及手術療效評估中的應用價值。采用實時熒光定量PCR檢測佳木斯市中心醫院2012年3月～2015年3月的19例肝癌血清標本中microRNA?152和microRNA?602的表達水平，分析microRNA?152和microRNA?602在乙型肝炎病毒（HBV）陽性組、HBV陰性組和健康對照組血清樣本中的表達差異。結果發現HBV陽性血清樣本中microRNA?152的表達水平（0.65±0.29）明顯低于健康組（1.21±0.32），microRNA?602在HBV陽性血清樣本中的表達（0.63±0.31）明顯高于健康組（0.44±0.15），且水平表達的差異具有統計學意義（p＜0.05）。可見血清樣本中的microRNA?152和microRNA?602可以用于HBV陽性肝癌診斷的血清標記物，microRNA?152可以用于HBV陽性肝癌術后效果評價的血清標記物。

HBV；肝癌；MicroRNA?152；MicroRNA?602

肝癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率排第三位，多發于東南亞及非洲。在我國，肝癌引發的死亡率占第二位，我國每年肝癌新發病例占全世界的55％，尋找有效的肝癌診斷標記物，研究肝癌治療手段及評估手術治療效果至關重要。MicroRNA是一類小分子核糖核酸，長度大約20～25個核苷酸，一個microRNA可調節包括轉錄因子、細胞因子以及受體在內的成百上千個靶基因，這就使得microRNA可以對細胞從增殖到分化再到凋亡的整個生命周期進行有效的調控，還可以參與個體胚胎發育的生物學過程、機體代謝的生理過程以及腫瘤發生、發展的生命過程等［1－2］。

近年來有很多學者都致力于microRNA的研究，例如microRNA?18、microRNA?21、microRNA?221、microRNA?122、microRNA?125a、microRNA?150等均在肝癌組織和正常組織中的表達顯示著明顯的差異性。各種研究表明了microRNA不僅可以作為肝癌早期診斷標記物，還可以作為肝癌治療效果評價的標記物。但是目前大多數的關于肝癌相關microRNA的研究都建立于腫瘤組織標本上，由于組織學腫瘤標記物存在標本采集受限、無法連續檢測和隨訪跟蹤不便等缺點，不便于在臨床開展。

MicroRNA?152和microRNA?602被證明在HBV相關性肝癌組織中存在異常表達，而在肝癌患者血清中的表達尚未明確。本文主要探討microRNA?152 和microRNA?602檢測在肝癌診斷及手術療效評估中的應用價值，采用實時熒光定量PCR檢測佳木斯市中心醫院2012年3月～2015年3月的19例肝癌血清標本中microRNA?152和microRNA?602的表達水平，分析microRNA?152和microRNA?602在HBV陽性組、HBV陰性組和健康對照組血清樣本中的表達差異［3］。

1 材料與方法

1.1 統計資料來源

收集佳木斯市中心醫院普外科2012年12月～2015年3月經病理切片證實為原發性肝癌且行手術切除的19例肝癌患者的血清標本作為實驗組，其中HBV陽性11例，HBV陰性8例，男性12例，女性7例，年齡分布在56±4.6。HBV陽性實驗組中ALT≤40U·L－1者4例，ALT＞40U·L－1者7例；AFP＜5μg·L－1者8例，AFP≥5μg·L－1者3例；腫瘤大小≥3cm者8例，腫瘤大小＜3cm者3例；Ⅰ期2例，Ⅱ期5例，Ⅲ期4例。HBV陰性實驗組中ALT≤40U·L－1者7例，ALT＞40U·L－1者1例；AFP＜5μg·L－1者4例，AFP≥5μg·L－1者4例；腫瘤大小≥3cm者5例，腫瘤大小＜3cm者3例；Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期4例。收集15例正常血清樣本作為健康對照組，男性8例，女性7例，年齡分布在55±9.2，ALT≤40U·L－1者14例，ALT＞40U·L－1者1例；AFP＜5μg·L－1者15例。各組別之間性別、年齡均無統計學差異（P＞0.05）。經過對實驗樣本資料的統計發現，HBV?DNA定量、腫瘤大小以及腫瘤分期在HBV陽性肝癌患者和HBV陰性肝癌患者的樣本中表達水平有顯著差異，具有統計學意義（P＜0.05）。

提取血清中的microRNA，采用熒光定量PCR各實驗組血清樣本中microRNA?152和microRNA?602的表達水平進行定量檢測，分析 microRNA?152和microRNA?602在各實驗組中的表達差異。

1.2 方法

首先用上海拜力生物科技有限公司生產的AM1560試劑盒提取并純化總的microRNA。然后用特殊設計的頸環結構的反轉錄引物，通過RT?PCR技術將microRNA單鏈逆轉錄成為互補 DNA，即cDNA，再以此為模板通過PCR擴增系統進行DNA擴增。最后通過熒光探針法定量PCR技術檢測樣品中 microRNA?152和 microRNA?602的表達水平［4－6］。提取血清中microRNA的方法如下：

①抽取大約2mL外周血，放入EDTA管內，輕輕混勻，是血與管內抗凝物質充分接觸，防止血細胞破裂。

②將盛有4mL全血的EDTA管放入4℃冰箱，在2h內分離血漿。

③離心10min，將上層液相小心吸出，避免吸取中間白色細胞層。

④將上層液相轉入事先預冷的1.5mL離心管子，離心10min，以便進一步分離血漿和血細胞。

⑤將第三步離心以后得到的血漿，以500μL的體積分裝，并轉入－80℃冰箱長期保存。

⑥使用AM1560試劑盒提取microRNA，具體操作方法見說明書。

⑦使用紫外分光光度儀ZF型測定microRNA的濃度和純度，具體操作方法見說明書［7－9］。

1.3 統計學處理

應用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析［10］，實驗組與對照組之間的年齡、AFP、HBV?DNA等定量臨床參數采用非配對t檢驗來確定組間差異，使用均數x－±s表示，各實驗組間microRNA?152和microRNA?602表達水平的差異顯著性使用U檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義，所有P均為雙側［11］。

2 結果分析

利用熒光定量PCR對健康對照組和HBV陽性肝癌患者術前、術后的血清樣本進行microRNA?152 和microRNA?602的定量檢測和分析，RT－PCR電泳圖見圖1和圖2。

實驗表明：（1）microRNA?152在HBV陽性肝癌患者術前實驗組中的表達明顯低于其在健康對照組中的表達（t＝3.75，P＝0.001），也明顯低于術后實驗組中的表達（t＝3.92，P＝0.003），且差異都具有統計學意義；（2）microRNA?602在HBV陽性肝癌患者術前實驗組中的表達明顯高于其在健康對照組中的表達（t＝3.13，P＝0.002），其術后實驗組中的表達也要高于健康對照組中的表達（t＝3.47，P＝0.001），且差異具有統計學意義，具體數據見圖3和圖4。

圖1 MicroRNA?152在HBV陽性肝癌實驗組中的RT?PCR電泳圖Fig1. MicroRNA?152 in HBV positive liver cancer rt?pcr electrophoresis figure in experimental group

圖2 MicroRNA?602在HBV陽性肝癌實驗組中的RT?PCR電泳圖Fig2 MicroRNA?602 in HBV positive liver cancer rt?pcr electrophoresis figure in experimental group

圖3 MicroRNA?152在HBV陽性肝癌各實驗組中的表達情況Fig.3 MicroRNA?152 in HBV positive expression in the experimental group of liver cancer

圖4 MicroRNA?602在HBV陽性肝癌各實驗組中的表達情況Fig.4 MicroRNA?602 in HBV positive expression in the experimental group of liver cancer

利用實時熒光定量PCR對健康對照組和HBV陰性肝癌患者術前、術后的血清樣本進行microRNA?152和 microRNA?602的定量檢測和分析，RT?PCR電泳圖見圖5和圖6。

實驗表明：（1）MicroRNA?152在HBV陰性肝癌患者在術前實驗組與健康對照組中的表達沒有顯著差異（t＝2.03，P＝0.07），術后實驗組與健康對照組中的表達也沒有顯著差異（t＝2.32，P＝0.09），都不具有統計學意義；（2）MicroRNA?602在HBV陰性肝癌患者在術前實驗組與健康對照組中的表達沒有顯著差異（t＝2.18，P＝0.12），術后實驗組與健康對照組中的表達也沒有顯著差異（t＝2.09，P＝0.11），都不具有統計學意義，具體數據見圖7和圖8。

圖5 MicroRNA?152在HBV陰性肝癌實驗組中的RT?PCR電泳圖Fig.5 MicroRNA?152 in HBV negative liver cancer rt?pcr electrophoresis figure in experimental group

圖6 MicroRNA?152在HBV陰性肝癌實驗組中的RT?PCR電泳圖Fig.6 MicroRNA?602 in HBV negative liver cancer rt?pcr electrophoresis figure in experimental group

圖7 MicroRNA?152在HBV陰性肝癌各實驗組中的表達情況Fig.7 MicroRNA?152 in HBV negative expression in the experimental group of liver cancer

圖8 MicroRNA?602在HBV陰性肝癌各實驗組中的表達情況Fig.8 MicroRNA?602 in HBV negative expression in the experimental group of liver cancer

3 討 論

研究發現，HBV陽性肝癌患者手術前血清樣本中microRNA?152的表達水平顯著低于健康對照組和手術后血清樣本中的表達水平，但microRNA?152 在HBV陰性肝癌患者術前、術后以及健康對照組的血清樣本中沒有顯著性差異，已有研究表明microRNA主要來源于細胞分泌，而HBV感染會導致肝細胞中microRNA?152的表達水平明顯下調，所以HBV陽性肝癌患者血清中microRNA?152表達水平顯著降低的主要原因在于HBV感染后抑制了肝細胞中microRNA?152的表達水平，從而抑制了細胞的主動分泌功能，導致肝癌血清中microRNA?152的表達水平下調。另外，本研究還發現，microRNA?152在肝癌患者術后血清樣本中的表達水平顯著高于術前血清樣本中的表達水平，這主要因為，實驗所選的術后血清樣本都在手術后2日內完成，手術對肝細胞造成的損傷還沒有恢復，可能導致肝細胞中microRNA?152漏入血液中，從而導致了術后血清樣本中microRNA?152的表達水平顯著升高。由于實驗條件有限，無法進行大樣本量的實驗，為了能夠更加深入的研究microRNA?152的機制，還需要長期跟蹤隨訪，進行大樣本量的長期研究。

該研究還表明，microRNA?602在HBV陽性肝癌患者術前和術后血清樣本中的表達水平都顯著高于健康對照組血清樣本中的表達水平，具有統計學意義（p＜0.05），但microRNA?602在術前與術后血清樣本中的表達無顯著性差異。我們還發現microRNA?602在血清樣本中的表達水平在早期已經出現升高，有可能是由于microRNA?602在損傷早期，尚未有形態學上的變化之前，已經通過某種機制由肝細胞轉移到血液循環。已有報道發現［12－15］，microRNA?602在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織中的表達水平，雖然研究的樣本類型不同，但是研究結果都指示了microRNA?602可能成為一種新的用于HBV陽性肝癌早期診斷的血清標記物，而microRNA?602在兩種不同樣本中表達之間的聯系還有待我們進一步的研究。

綜上所述，該研究發現在 HBV陽性肝癌患者術前血清樣本中microRNA?152和microRNA?602存在表達異常的現象，在HBV陽性肝癌患者術前和術后血清樣本中microRNA?152的表達也有顯著性的差異，這些研究表明了microRNA?152和microRNA?602可以用于HBV陽性肝癌早期診斷的血清標記物，而且microRNA?152也有成為一種重要的HBV陽性肝癌手術治療效果的評價指標，但是microRNA?152和microRNA?602在肝臟細胞中并不具有特異性，它們能否如該研究預期的一樣，成為HBV陽性肝癌早期診斷的血清標記物還有待更進一步的證實，尤其microRNA?152在術前和術后血清樣本中差異表達的確切機制更加需要大量樣本的研究。

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Study on the expression and diagnostic significance ofm icroRNA?152 and microRNA?602 in hepatocellular carcinoma

ZHOU Yibing
（Jiamusi Center Hospital General Surgery，Heilongjiang Jiamusi 154002，China）

To explore the application value ofmicroRNA?152 and microRNA?602in the diagnosis of liver cancer and evaluation of therapeutic effects.The serum microRNA was extracted，and the levels of circulatingmicroRNA?152 and microRNA?602 were quantified by real?time quantitative RT?PCR.Expression differences ofmicroRNA?152 and microRNA?602 were analyzed in every experimental groups.Results show the expression level of the HBV positive hepatocellular carcinomamicroRNA?152 was significantly lower than that in the healthy group（p＜0.05），while the expression level of microRNA?602 was higher than that in the healthy group（p＜0.05）.It is speculated that microRNA?152 and microRNA?602may be employed as novel serum markers for the diagnosis of HBV?positive liver cancer and microRNA?152 may be employed as novel serum markers for the evaluation of therapeutic effect.

Hepatitis B Virus；Hepatocellular Carcinoma；MicroRNA?152；MicroRNA?602

A

1672－5565（2015）03－192－06

2015－05－12；

2015－07－14.

周軼冰，男，主治醫師，研究方向：腫瘤的血清標記物；E?mail：ttabb1021＠163.com.