莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病帶菌種子萌發的影響

謝 燕，夏日照，仇佳偉，張 亞，廖曉蘭

（湖南農業大學植物保護學院，植物病蟲害與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病帶菌種子萌發的影響

謝 燕，夏日照，仇佳偉，張 亞，廖曉蘭

（湖南農業大學植物保護學院，植物病蟲害與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

采用抑菌圈法測定莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病菌的毒力，平皿培養法測定莧菜活性物對帶菌西瓜種子萌發的影響。結果表明，莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病菌的最小抑菌濃度為5Mg/ML，E C50為146.349 2Mg/ML；無菌種子、帶菌種子、16.6%乙醇處理的帶菌種子、莧菜活性物處理的帶菌種子的發芽勢分別為87.3%、42.7%、48.0%、60.0%，發芽率分別為93.3%、54.7%、58.7%、90.0%；經5Mg/ML的莧菜活性物處理的帶菌西瓜種子的發芽勢和發芽率分別為64.7%和90.7%，而經80Mg/ML的莧菜活性物處理的帶菌種子的發芽勢和發芽率分別為3.3%和4.7%。這表明莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病菌有較強抑制作用，在低濃度時既有抑菌效果又可促進種子萌發，極具開發和應用前景。

西瓜細菌性果斑病；抑菌作用；發芽率；發芽勢

西瓜細菌性果斑病是我國一種限制入境的檢疫性病害，其病原菌為嗜酸菌屬西瓜種（Acidovorax citrulli）。高溫高濕環境下，西瓜細菌性果斑病菌繁殖迅速，苗期感染會導致爛苗，果實膨大期感染可使西瓜減產20%以上[1]。近年來，我國多地相繼爆發該病，給西瓜種植業造成巨大的經濟損失。西瓜細菌性果斑病是典型的由種子帶菌引起的傳染性病害[2]，其病原菌一般附著在種子表皮上，有時也侵入種子內部，而且存活時間長，一般可存活4～5個月，抗逆性、抗干旱能力和致病力較強[3-4]，可抑制種子萌發。

為了解決西瓜細菌性果斑病菌對種子萌發的危害，在前期研究的基礎上，考察了莧菜活性物對西瓜帶菌種子萌發的影響，以期為莧菜抗菌資源的合理開發提供理論基礎和科學依據[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌種為西瓜細菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli），由湖南農業大學植物病理實驗室提供。供試植物為莧菜，由湖南農業大學瀏陽科研基地提供。供試西瓜種子為洞庭一號，購于馬王堆蔬菜市場。供試培養基為牛肉膏蛋白胨培養基（NA），配方如下：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂條24.0 g、蒸餾水1 000ML、pH值7.0～7.2。

實驗主要設備有旋轉蒸發儀RE-52A（上海雅榮生化儀器設備有限公司）、循環水真空泵SHZ-DII（I上海羌強儀器設備有限公司）、臺式恒溫震蕩器（上海精宏實驗設備有限公司）、節能型智能恒溫槽DC-2006（寧波新芝生物科技股份有限公司）、超聲波清洗器KQ3200DE（昆山市超聲儀器有限公司）、XY-200型高速多功能粉碎機（浙江省永康市松青五金廠）、人工氣候箱QHX-400B5H-Ⅲ（上海新苗醫療器械制造有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 莧菜活性物的制備 將新鮮莧菜葉洗凈曬干，高速粉碎至60～90目，取20 g莧菜葉干粉，加入400 ML乙酸乙酯，25℃下120 r/Min震蕩24 h，過濾，收集濾液；重復提取1次，合并濾液，于40℃旋轉蒸發至膏狀物，再用16.6%乙醇溶解定容至100mg/ML，即莧菜活性物母液。

1.2.2 西瓜細菌性果斑病菌室內毒力測定 將活化24 h的西瓜細菌性果斑病病菌用無菌水配制成濃度為3×108cfu/ML的細菌懸浮液，再將莧菜活性物稀釋配制成80、40、20、10、5、2.5mg/ML的濃度梯度。參考孫長霞[6]的平板打孔法測定莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病菌的室內毒力。方法如下：取200 L細菌懸浮液均勻涂布于NA平板上，然后在平板中央打孔（φ=7 mm），在孔中分別注入不同濃度的莧菜活性物60 L，以農用硫酸鏈霉素作對照，于28℃恒溫培養48 h，每個處理重復3次，培養結束用十字交叉法測量抑菌圈直徑，并計算毒力回歸方程和EC50。

1.2.3 低濃度的莧菜活性物對帶菌西瓜種子萌發的影響 （1）帶菌種子制備。供試種子經45℃干熱消毒72 h。將種子浸入3×108 cfu/ML西瓜細菌性果斑病菌菌懸液中，于30℃下150 r/Min振蕩培養2 h，讓西瓜細菌性果斑病菌接種到種子上獲得帶菌種子。同時用無菌種子以無菌水作相同的處理為空白對照，接種后將種子迅速風干[7]。（2）實驗設計。將帶菌種子分成3組，分別加入無菌水、16.6%的乙醇和濃度為5mg/ML的莧菜活性物，空白對照為無菌種子加無菌水，分別浸泡60Min，每組150粒[8]，每個處理重復3次。（3）種子萌發。在無菌培養皿中鋪一層無菌棉，無菌棉上再鋪一張無菌濾紙，將浸泡后的種子用清水反復沖洗3次，稍晾干后置于培養皿中在28℃下光照培養，以種子發芽露白為標準，分別在第4天和第10天記錄種子萌發情況。

1.2.4 不同濃度的莧菜活性物對帶菌西瓜種子萌發的影響 帶菌種子的獲取同上，將帶菌種子分成5組，分別置于濃度為80、40、20、10、5mg/ML的莧菜活性物溶液中，浸泡60Min后取出種子，用清水沖洗3次；每個處理重復3次。種子萌發處理同上，以種子發芽露白為標準，分別在第4天和第10天記錄種子萌發情況。

1.2.5 數據分析與統計方法 采用DPS等數據分析軟件對試驗數據進行整理和分析。試驗所用公式如下：

抑制率（%）=（處理抑菌帶寬－對照抑菌帶寬）/（對照菌落覆蓋圈直徑－孔徑）×100[9]

種子發芽勢（%）=4 d內正常發芽粒數/供試種子粒數×100

種子發芽率（%）=10 d內正常發芽粒數/供試種子粒數×100

2 結果與分析

2.1 莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病菌的室內毒力測定

2.1.1 最小抑菌濃度測定 由圖1可知，莧菜活性物濃度越高，其抑菌活性越強，當濃度為5mg/ML時，莧菜活性物的抑菌效果較弱，濃度為2.5mg/ML時，莧菜活性物對病原菌無抑菌效果。由此可知，莧菜活性物有較好抑菌效果，對西瓜細菌性果斑病菌的最小抑菌濃度為5mg/ML。

圖1 莧菜活性物的最小抑菌濃度測定

2.1.2 EC50測定 根據莧菜活性物的最小抑菌濃度，選取80、40、20、10、5、2.5mg/ML的莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病菌進行室內毒力測定，以農用硫酸鏈霉素作為藥劑對照。由表1可知，莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病菌的EC50為146.349 2mg/ML；農用硫酸鏈霉素EC50是2.775 4mg/ML。

2.2 莧菜活性物對西瓜種子發芽的影響

2.2.1 低濃度的莧菜活性物對帶菌西瓜種子發芽的影響 由表2可知，不同處理對西瓜種子發芽勢和發芽率有明顯不同的影響。無菌種子、帶菌種子、16.6%乙醇處理的帶菌種子、莧菜活性物處理的帶菌種子的發芽勢分別為87.3%、42.7%、48.0%、60.0%，其發芽率分別為93.3%、54.7%、58.7%、90.0%。無菌水處理的帶菌種子與16.6%乙醇處理的帶菌種子的發芽率和發芽勢無顯著差異，說明溶劑對種子的發芽勢和發芽率影響不大；用莧菜活性物處理過的帶菌種子的發芽率和發芽勢與無菌種子的發芽率和發芽勢無顯著差異，而用莧菜活性物處理過的帶菌種子與不經處理的帶菌種子相比，兩者的發芽勢與發芽率存在極顯著的差異，說明莧菜活性物可以殺死帶菌種子中的病菌，起到種子消毒的作用，從而提高種子的發芽率。

表1 莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病的毒力回歸方程

表2 不同處理下西瓜種子發芽勢及發芽率的比較

2.2.2 不同濃度莧菜活性物對帶菌西瓜種子發芽的影響 從表3中可以看出，不同濃度的莧菜活性物對西瓜種子發芽勢和發芽率有不同程度的影響。經低濃度（5mg/ML）、中低濃度（10mg/ML）、中濃度（20 mg/ML）、中高濃度（40mg/ML）、高濃度（80mg/ML）莧菜活性物處理的帶菌種子發芽勢分別為64.7%、51.3%、46.0%、14%、3.3%，發芽率分別為 90.7%、62.0%、49.3%、17.3%、4.7%，處理間的差異均達極顯著水平。與低濃度莧菜活性物相比，中濃度活性物和高濃度活性物顯著降低了帶菌西瓜種子的發芽率和發芽勢。由此可知，高濃度莧菜活性物雖然抑菌活性較強，但它對種子的發芽勢和發芽率也有抑制作用，不利于種子萌發；而低濃度的莧菜活性物雖然抑菌活性不那么強，但對西瓜種子的發芽率和發芽勢沒有不良影響。因此，低濃度的莧菜活性物對西瓜帶菌種子的消毒效果較好，有利于促進種子萌發。

表3 不同濃度的莧菜活性物處理下西瓜種子發芽勢及發芽率的比較

3 結論與討論

實驗結果表明，莧菜活性物對西瓜細菌性果斑病菌有較強的抑制作用，且低濃度的莧菜活性物既能殺死種子上的病菌又能促進種子萌發，顯著提高種子的發芽率和發芽勢，而高濃度莧菜活性物對種子萌發有一定的抑制作用，可能是因為莧菜活性物成分復雜，除了抑菌物質，還有其他物質存在，具體原因有待進一步研究。

西瓜細菌性果斑病是典型的由種子帶菌引起的傳染性病害，防治困難，市面上有很多種子處理劑，且多以化學藥劑為主，倘若在使用過程中操作不當，將存在較大安全隱患，或者影響種子萌發[10]。現在很多植物資源的提取物具有抑菌作用，但是主要以中草藥植物為主。莧菜作為一種可食用蔬菜，目前的開發利用主要體現在其食用價值、工業價值、觀賞價值、飼用價值及醫用價值上，未見有對植物病原細菌抑制作用方面的研究。該研究證實莧菜活性物對細菌性果斑病菌有較好的抑制作用，其抑菌活性成分相對安全可靠，在一定程度上避免了化學藥劑不安全、不環保的缺點，增加了莧菜植物資源的農用價值，極具開發和應用前景。

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[3]李 鵬，古勤生，彭 斌，等.西瓜細菌性果腐病病種子帶菌試驗和發病因素的研究[A].中國植物病理學會：中國植物病理學會2006年學術年會論文集[C].北京：中國農業科學院出版社，2006.118.

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（責任編輯：成 平）

GerMination Effects of Active Ingredient in Amaranthus Tricolor on Seeds ContaMinated Acidovorax Citrulli

XIEYan，XIA Ri-zhao，QIU Jia-wei，ZHANG Ya，LIAO Xiao-lan
（College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests,Changsha 410128,PRC）

Inhibition zone measure w as used for allied toxicity measurement of acitive ingredient in Amaranthus tricolor against Acidovorax citrulli,and platiculturewasused formeasure the influenceof acitive ingredienton thegermination of contaminated seeds.The results showed that the MIC and EC50for active substanceson Acidovorax citrullias follows:MIC=5mg/ML and EC50=146.3492mg/mL. The gerMination potential of sterile seeds,contaMinated seeds,contaMinated seeds treated w ith 16.6%ethanol and contaMinated seeds treated w ith active ingredientwere 87.3%,42.7%,48.0%and 60.0%respectively.W ith respect to the gerMination rates they were 93.3%, 54.7%,58.7%and 90.0%respectively.How ever,the gerMination potentialand the gerMination rate of contaMinated seedsw hich treated by 5 mg/ML active ingredientwere 64.7%and 90.7%，w hile those of which treated by 80 mg/ML active ingredientwere 3.3%and 4.7%. Finally,w e can conclude that the active ingredienthave a good effecton the inhibition of Acidovorax citrulli,aswellas they can accelerate gerMination in low concentration.

Acidovorax citrulli;nhibitory effect;gerMination rate;gerMination potential

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.014

S351.1

A

1006-060X（2015）03-0038-03

2015-03-26

國家自然科學基金資助項目（31070397）

謝 燕（1989-），女，湖南長沙市人，碩士研究生，主要從事植物病害的生物防治研究。

廖曉蘭