八仙花葉片誘導再生技術

趙盈盈，彭盡暉，陳小超，黃 宇

（湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128）

八仙花葉片誘導再生技術

趙盈盈，彭盡暉，陳小超，黃 宇

（湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128）

以八仙花（Hydrangea macrophylla 'Adria）' 紅色品種無菌苗為試驗材料，使用其葉片為外植體進行再生研究，建立了八仙花葉片高效離體再生體系。結果顯示：適宜的葉片誘導愈傷培養基為MS+6-BA 2.5Mg/L+IAA 0.2Mg/L，出愈率達100%；適宜的芽直接誘導分化培養基為MS+6-BA 3.0Mg/L+N AA 0.3Mg/L，分化率可達80%；暗培養15 d是葉片誘導芽再生最適合的時間。最適宜的葉片切割大小是垂直于主脈切兩刀，但是不能斷開，此時芽誘導率最佳。切取3 c m高的無菌苗接種在生根培養基上，最適宜的生根培養基為1/2MS+蛭石和珍珠巖各一半混合，不添加激素，生根率達100%，且根生長健壯。

八仙花；葉片再生；暗培養

八仙花（Hydrangeamacrophylla）為虎兒草科木本觀賞植物，原產于中國和日本。因其花大色艷，寓意美好，深受人們的喜愛[1]?，F代花卉市場上，八仙花的生產量遠不及其需求量。關于八仙花組織培養的報道較多，任叔輝等[2-7]以八仙花帶腋芽的莖段、莖尖、葉柄和葉片為外植體，分別獲得了八仙花的再生體系。2011年馮潤東等[8]報道了八仙花組織培養技術，之后劉峰[9]以八仙花葉片為外植體，誘導出了不定芽，王忠武[10]報道了關于八仙花莖尖離體培養，但近年來幾乎沒有關于八仙花組織培養技術的報道。八仙花多為不育花，難以通過傳統的雜交育種獲得優良性狀，而分子技術的興起克服了這一障礙。分子技術育種可以定向修改某一特定形狀而不改變其原有的性狀，但是遺傳轉化需要良好的受體，而植物葉片是分子轉化中最佳受體。因此，研究植物葉片再生可以為今后分子遺傳轉化提供良好的受體[1]。關于植物葉片直接再生的研究較多，最近報道的有關于無患子優樹[11]、‘惠’蘋果自交實生苗[12]、歐洲甜櫻桃砧木‘SL64’離體[13]、結球甘藍離體[14]、玫瑰[15]、‘北林雄株1號’和‘北林雄株2號’[16]及番茄[17]等植物葉片再生的研究。本試驗主要研究八仙花葉片直接再生體系的建立，為今后八仙花分子遺傳轉化試驗提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為八仙花紅色品種（H.macrophylla 'Adria）'，見圖1所示，由湖南農業大學觀賞園藝研究所提供。

圖1 試驗八仙花品種

1.2 試驗方法

1.2.1培養條件 光照時間約14 h，光照強度約1 500～2 000 lx，培養溫度25℃左右。

1.2.2 八仙花葉片愈傷組織誘導培養 挑選長勢一致、生長健壯的八仙花組培苗，選取頂端葉面充分展開的幼嫩葉片，垂直葉片主脈方向剪切3～5個傷口將其葉背朝下與誘導培養基充分接觸培養。接種于以MS為基本培養基，添加不同配比激素的培養基上。每個處理接種10瓶且每瓶接種5個葉片，設3個重復接種后70 d觀察愈傷組織的分化情況，統計其出愈率。

1.2.3 八仙花葉片不定芽直接誘導培養 以MS為基本培養基，添加不同配比激素的培養基上。接種后70 d檢查出芽率。

1.2.4 葉片切割大小對芽直接再生的誘導 將生長健壯的葉片切割成面積大小不同的正方形，轉接到6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L的培養基上，先放到暗條件下培養15 d后，轉到其他條件相同的光下培養。70 d后觀察芽的增殖情況。

1.2.5 暗培養對芽直接再生的誘導 設置暗培養0 10、15、20、25 d 5種處理，黑暗培養完成后將其轉到光下繼續培養；以0 d暗培養為對照。接種70 d統計其出芽率。

1.2.6 再生植株的生根培養 將生長至3 cm以上的不定芽轉入生根培養基進行生根誘導，每組處理接種2瓶，每瓶接種5個不定芽，設3次重復。培養基均為1/2MS培養基，不添加任何激素。25 d后觀察其生根情況，統計其平均根長，平均生根數和生根率。

1.2.7 計算公式 出愈率（%）=（產生愈傷葉片數/接種總葉片數）×100

出芽率（%）=(分化芽的葉塊數/接種的葉塊數)× 100

再生芽平均數（個）=葉片再生芽的總數/再生芽的葉片數

生根率(%)=(生根試管苗數/接種試管苗數)×100

2 結果與分析

2.1 八仙花葉片愈傷組織誘導培養基篩選

由表1可知，處理1的出愈率在6組培養基中最低，僅為54%。隨著6-BA的濃度增加到2.5mg/L，出愈率提高到100%。處理5產生愈傷葉片個數最多，平均為50個，即所有的葉片均能在此培養基上產生愈傷。從表1中還可以看出，隨著6-BA濃度的增加，出愈率也隨著增加，說明在一定情況下高濃度的細胞分裂素有利于細胞的分化，但是當濃度增加到3.0mg/L時，出愈率減弱，說明較高的細胞分裂素能夠抑制葉片愈傷組織的產生。由此可知，2.5mg/L的6-BA有利于八仙花葉片產生愈傷組織。因此，處理5（MS+ 6-BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L）是最適合八仙花葉片愈傷組織誘導的培養基。

表1 不同培養基對八仙花葉片出愈率的影響

2.2 葉片切割大小對芽誘導的影響

由表2可知，將葉片切割成大小不同的正方形接種于培養基上，葉片切割較小時，出芽率芽和平均數都較低，不利于芽的再生。但是將整個葉片垂直于主脈切兩刀，出芽率可達90%，芽平均數也達到了7.2個。由此可知：八仙花葉片再生最佳切割方式是，不應將主脈切斷，而是傷其主脈后直接將整個葉片放在培養基上培養。

大?。╟ m）3 × 3 5 × 5整片葉片接種葉片（片）1 0 1 0 1 0分化葉塊（塊）1 6 9芽分化（個）1 3 1 6 6出芽率（%）1 0 6 0 9 0芽平均數（個）1 . 0 5 . 0 7 . 2

2.3 八仙花葉片不定芽直接誘導培養基的篩選

將生長健壯的葉片放入芽誘導培養基上，不同濃度激素的培養基對葉片直接誘導芽的產生影響很大。表3表明：10組處理中，處理8分化的葉片數最多，為43個，芽誘導率最高達86%，不定芽分化總數可達172個，單個葉片平均分化芽數也最多，高達4.0個，與其他培養基的分化率差異也較為顯著。與處理8相比，處理7雖然只有28個葉片有芽的分化，但是其平均再生芽個數也達到了4.0個，且芽生長粗壯，顏色濃綠，傷口處還有顏色濃綠、生長緊密的愈傷組織出現。處理9雖然出芽率可達78%，但是其平均再生芽個數較少，其芽較為健壯。由以上數據可知，要讓葉片直接分化出芽，且芽健壯易于在繼代培養基上增殖生長，最適的培養基為處理8即6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L。

2.4 暗培養對芽直接再生的誘導

暗培養一段時間有利于芽的分化[6]。由表4可知：八仙花在暗處理15 d后芽的分化率最高，芽分化平均數可達7.2個。八仙花葉片增殖過程如圖2所示，重芽分化量多，且芽生長健壯。但是過長時間的暗培養處理，不利于芽的分化。研究還發現，在黑暗條件下，八仙花葉片很難分化愈傷組織，但是將葉片進行一段時間的暗處理，然后將其在光照下培養，在較短的時間內就有大量的愈傷分化。

表3 不同激素對八仙花不定芽誘導率與再生芽數的影響

2.5 再生植株的生根誘導培養

從表5可知：在不同基質上，八仙花幼苗均能長出根來，且生根率在80%以上，其中處理1、2、4、5的生根率可達到100%。其中處理4、5、7的平均生根數達到14條及以上，且處理5的生根數達到了25以上，根系生長粗壯濃密，且有側根的分化，芽生長健壯。由此可知，粗蛭石+珍珠巖作為八仙花生根誘導的基質更加有利于根的分化和生長，而直徑較小的細蛭石和凝固的瓊脂會產生大量氣生根。所以，粗蛭石+珍珠巖是八仙花根誘導分化的最佳基質。如圖3所示，6種基質各有優缺點。瓊脂能更好地固定不定芽，但是其透氣性相對較差，容易被細菌污染導致植株死亡；細蛭石和珍珠巖，可以相對好的保水和固定無菌苗，但其透氣性也相對較弱，易導致植株與其接觸部分潰爛，使植株后期生長較弱；粗蛭石雖然透氣性較好，但是保水能力相對較弱，不易固定植株；植株入土種植后生長更加健壯，且根系發達。但是從后期生長來看，粗蛭石+珠巖的苗子能更好地適應環境。

表4 暗處理對八仙花葉片分化的影響

圖2葉片增殖過程（A，接種5 d的葉片；B，開始出現芽點；C，出現一個子葉；D，出現兩片子葉；E、F，大量芽產生；G，轉入繼代培養的芽）

3 討論與結論

植物激素對八仙花葉片的出愈率和芽誘導率都有較大的影響。在八仙花葉片愈傷組織誘導的過程中，隨著細胞分裂素即6-BA濃度的增加，出愈率呈現先升高后降低的變化，因而選擇適當的細胞分裂素濃度對八仙花葉片直接再生誘導有著極為關鍵的意義。選擇較高的細胞分裂素和較低的生長素，有利于愈傷組織的分化。細胞分裂素與生長素NAA的比值在3.0∶0.3時，有利于芽的直接再生。

表5 不同基質對八仙花不定芽生根的影響

圖3 植株生根培養

適當的暗培養可促進芽的分化，但應注意的是暗培養時間過長，不但不能促進芽的分化，愈傷組織也很難形成。劉峰[9]在研究八仙花葉片分化時，也發現了一定的暗培養可以誘導芽的分化。師校欣等[18]認為，暗培養可以促進試管苗的生長與生根，這與內源激素的變化有關，通常認為生長素可促進生根，生長素IAA易在光照條件下分解。但也有報道認為，暗處理可使黑桃試管苗生根率提高，而在光照條件下IAA含量始終大于暗培養條件[19]。暗培養促進芽分化與暗培養促進根的生長有什么不同的地方還無從得之，也沒有相關的文獻報道，光照條件為何會導致芽分化率降低且分化速度緩慢，還需要進一步的研究證明。

本試驗采用在1/2MS培養基的營養液中，加入不同基質誘導八仙花幼苗生根。添加的幾種基質，市場上容易買到，價格便宜，能重復利用，且生根率高，不易有氣生根的產生。氣生根的產生，可能是因為瓊脂和細蛭石之間空隙較小，氧氣缺乏。使用粗的蛭石幾乎無氣生根產生。

最近的研究主要集中于獲得八仙花的脫毒苗，而八仙花外植體消毒，品種差異大，不定芽分化率低等問題仍然是急需解決的問題[1]。而之前的文章主要介紹了快速繁殖獲得無菌苗運用在生產上，少有文章提及分子技術遺傳育種。本試驗中采用葉片為外植體，建立八仙花高效再生體系，可為八仙花今后的分子育種提供基礎。

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（責任編輯：盧紅玲）

Leaf Regeneration Technology of Hydrangea Macrophylla

ZHAO Ying-ying，PENG Jin-hui，CHEN Xiao-chao，HUANG Yu
（College of Horticulture and Landscape,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC）

An efficaciousmethod for plants regenerate froMleaf exp lants of Hydrangeamacrophylla was established.The optimal callus inducingmediuMfor Hydrangeamacrophylla leaveswasMS+6-BA 2.5mg/L+IAA 0.2mg/L,and the callus induction rateswas 100%. The resultsshowed thatbud differentiation thegreatmediuMwasMS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L,and thebud differentiations rate was80%.The proper timewhich could promote bud’sdifferentiation of the leafwas darkness treatment for15 days.Perpendicular to the main vein cut two kniveswas bestway to the bud differentiations.Buds over 3 cMheightcould forMadventitious roots in 1/2MS+50% vermiculite+50%perlitewithouthormone,and the rateof rootingwasup to 100%.

Hydrangeamacrophylla;leaf regeneration;dark treatment

S685.99

A

1006-060X（2015）04-0081-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.026

2014-10-30

國家自然基金青年項目（N o.31201656）；湖南省大學生科技創新項目（C X1112）

趙盈盈（1989-），女，貴州綏陽縣人，碩士研究生，研究方向為觀賞園藝分子技術。

彭盡暉