節桿菌與施氏假單胞菌對甲基對硫磷的共降解研究

史延華，任 磊，賈 陽，閆艷春

（中國農業科學院研究生院，北京100081）

節桿菌與施氏假單胞菌對甲基對硫磷的共降解研究

史延華，任 磊，賈 陽，閆艷春

（中國農業科學院研究生院，北京100081）

為實現對有機磷農藥甲基對硫磷的徹底降解，研究利用有機磷農藥降解菌施氏假單胞菌Y C-Y H1與對硝基苯酚降解菌C N2對甲基對硫磷進行共降解試驗，同時克隆了參與降解過程的相關基因，并對2株菌株在對甲基對硫磷污染土壤的原位修復中的效果進行研究。結果表明，與Y C-Y H1單獨降解相比，Y C-Y H1和C N2共降解在處理前32 h無較大差異；但之后，甲基對硫磷和對硝基苯酚的降解速度明顯加快，處理48 h后甲基對硫磷即被完全降解，比單獨用Y C-H1降解時提前了16 h，處理64 h時對硝基苯酚就被完全降解。而土壤修復的研究結果表明，菌株Y C-Y H1與C N2能夠高效降解甲基對硫磷，72 h對土壤中100Mg/k g甲基對硫磷的降解率接近100%，尤以未滅菌土壤中降解效果更好。

甲基對硫磷；對硝基苯酚；施氏假單胞菌；節桿菌；共降解

生物降解作為消除環境有機污染物的方式之一，被認為是重要的環境物質平衡策略。由于農藥在農業生產及日常生活中的重要作用，其使用頻率和使用量越來越大[1]，隨之引起的食品安全和環境污染等問題也越來越受人們關注。大部分農藥是可以降解的，且已有較多相關的研究報道，但仍然有許多盲點值得關注[2]：（1）農藥在低濃度下較難被降解，如濃度達到毫克級以下時，不論生物降解還是理化降解成效都不顯著；（2）農藥的生物降解在極端條件下較難起作用，例如地下水、湖泊深層淤泥和海水等環境；（3）農藥轉化的代謝中間產物也具有相當的毒副作用，應予以關注。例如，3,5,6-三氯-2吡啶酚作為毒死蜱的主要降解產物，雖然毒性相對于毒死蜱大大降低，但由于其半衰期較長，且具有較強的抑菌活性以及潛在的致癌風險，對生態環境及人體健康的威脅不容忽視[3]。

甲基對硫磷是一種高效、高毒的有機磷殺蟲劑，被廣泛應用于農業生產中。但其殘留期長，具有較高神經毒性[4-6]。因此，甲基對硫磷的生物降解一直是人們研究的熱點。目前，已證實可降解甲基對硫磷的菌株分別屬于芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、節桿菌屬、克雷伯氏菌、木霉屬等[7-10]。

有研究表明，微生物的水解酶通常作用于甲基對硫磷的P-O酯鍵，將甲基對硫磷水解為二甲基硫代硫酸酯和對硝基苯酚。雖然對硝基苯酚的毒性與甲基對硫磷相比下降了幾十倍[11]，但是其半衰期仍然較長，且具有良好的水溶性，故對硝基苯酚能夠長時間殘存于環境中，并可隨地表水遷移至地下水系統，給生態環境和人體健康帶來較大威脅[12]。因此，研究對硝基苯酚的生物降解途徑對徹底解決甲基對硫磷的污染問題有重要意義。

研究以有機磷農藥降解菌施氏假單胞菌YCYH1和對硝基苯酚降解菌節桿菌CN2為材料，通過基因克隆初步探討2株降解菌對甲基對硫磷的降解途徑，并通過土壤降解試驗研究這2株菌株對污染環境原位修復的應用潛能，以期為生物修復甲基對硫磷污染土壤提供理論依據與技術參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

1.1.1 供試菌株 供試菌株為施氏假單胞菌YC-YH1（Pseudomonas stutzeri）和節桿菌屬細菌CN2（Arthrobacter sp.），由中國農業科學院研究生院生物學教研室提供；它們的16S rRNA基因序列均已遞交GenBank，登錄號分別為KJ786450和EU266494。

1.1.2 供試藥品 研究所用甲基對硫磷（純度97.2%）與對硝基苯酚（純度99.1%）均為分析純級（國藥集團）。其中，甲基對硫磷用無水乙醇溶解配制成濃度為2×104mg/L的母液；對硝基苯酚用純水配制成濃度為2×104mg/L的母液；備用。高效液相色譜使用的乙腈和甲醇均為色譜純級（美國Fisher公司）。

1.1.3 培養基 普通培養基（LB）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl10 g，去離子水1 L，pH值7.2±0.2。無機鹽離子培養基（MSM）：NH4NO31.0 g，NaCl 0.5 g，（NH4）2SO40.5g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，去離子水1 L，pH值7.2±0.2。上述培養基中加入1.5%的瓊脂粉即得到對應的固體培養基，所有培養基均在121℃滅菌30Min備用。

1.1.4 供試土壤與主要試驗儀器 供試土壤為中國農業科學院西門花園內土壤，無有機磷農藥使用記錄。高效液相色譜儀為安捷倫1 200（Agilent，USA），色譜柱為Zorbax Eclipse PlusC18（4.6mm×150mm× 5μm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株對底物的降解效果 施氏假單胞菌YC-YH1降解甲基對硫磷的效果以及節桿菌CN2降解對硝基苯酚的效果通過水解圈試驗進行展示。具體方法如下：（1）分別制備含100mg/L甲基對硫磷的LB固體平板和100mg/L對硝基苯酚的LB固體平板，備用；（2）向LB液體培養基中分別接入YC-YH1與CN2，培養至對數期（OD600=0.6～0.8），備用；（3）用已滅菌的濾紙片（r=0.8 cm）分別蘸取菌液，放入相應的LB固體平板中央（YC-YH1放入含甲基對硫磷的平板，CN2放入含對硝基苯酚的平板）；（4）在30℃下避光培養，間隔一定時間進行觀察并拍照。

1.2.2 降解相關基因的克隆 根據已有文獻報道[13-16]，分別選取甲基對硫磷水解酶基因mpd、有機磷水解酶基因ophC2和opdA以及對硝基苯酚降解相關基因npdA1和npdA2，作為目標序列進行引物設計，引物序列見表1。通過PCR反應對目標基因進行檢測，PCR反應條件：95℃預熱5Min；95℃18 s，60℃18 s，72℃，mpd、ophC2和npdA1為1Min，opdA與npdA2為2Min，循環34次；72℃10min；10℃30Min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性結果測序（上海生工生物工程股份有限公司），對測序結果進行BLAST比對分析并將測序結果遞交GenBank。

表1 本研究所用引物及引物序列

1.2.3 YC-YH1與CN2對甲基對硫磷的共降解 向LB液體培養基中分別接入YC-YH1與CN2，培養至對數期。取一定體積的培養液，6 000 rpm離心3Min收集菌體，并用新鮮MSM培養基清洗，再次離心收集菌體，重懸于等體積的新鮮MSM培養基中備用。首先，分別配制含100mg/L甲基對硫磷和100mg/L對硝基苯酚的MSM培養基，并按照10%（V︰V）的接種量接種YC-YH1和CN2菌種，其中YC-YH1接入含甲基對硫磷的MSM培養基，CN2接入含對硝基苯酚的MSM培養基；以含相同濃度底物但不接菌的MSM培養基作為對照組；每個處理3次重復。于30℃下振蕩培養，轉速180 rpm/Min，每8 h取樣1次，分別測定甲基對硫磷與對硝基苯酚的濃度。其次，向含100mg/L甲基對硫磷的MSM培養基中，同時接入YC-YH1與CN2各10%。以含相同濃度甲基對硫磷但不接菌的MSM培養基作為對照組。每個處理3次重復。于30℃下振蕩培養，轉速180 rpm/Min，每8 h取樣一次，分別測定甲基對硫磷與對硝基苯酚的濃度。1.2.4 模擬原位土壤修復 供試土壤過20目篩，部分進行滅菌處理（121℃，1 h）。取已滅菌的250ML三角瓶，分別裝入100 g滅菌與未滅菌的土壤，兩種土壤中均加入甲基對硫磷至終濃度為100mg/kg。取培養至對數期的YC-YH1和CN2菌液，離心收集菌體沉淀，并用新鮮無菌的MSM清洗、重懸，將菌懸液分別加入滅菌土壤和未滅菌土壤中，YC-YH1和CN2至各自濃度約104～105 cfu/g，以不接菌且含相同濃度甲基對硫磷的未滅菌土壤作為對照組。在溫度30℃，相對濕度10%左右的環境下進行培養，每12 h取樣一次，分別測定甲基對硫磷和對硝基苯酚濃度。每個處理3次重復。

1.2.5 甲基對硫磷和對硝基苯酚提取 每個處理組分別取10 g土壤，加入20ML丙酮，在搖床中劇烈震蕩1 h，4℃靜置過夜，取2ML過無水Na2SO4柱收集丙酮溶液，以氮氣吹掃使丙酮完全揮發，加入正己烷使溶質復溶并經0.22μm的有機相濾膜進行過濾，此樣品用于甲基對硫磷濃度檢測。另取10 g土壤，加入20ML滅菌純水，在搖床中劇烈震蕩1 h，4℃靜置過夜，以0.22μm的濾膜進行過濾，此樣品用于對硝基苯酚濃度檢測。獲得樣品均使用高效液相色譜進行檢測。

1.2.6 甲基對硫磷和對硝基苯酚測定 制備的樣品經0.22μm的濾膜過濾后，分別在254 nm（甲基對硫磷）和320 nm（對硝基苯酚）波長處進行濃度測定。甲基對硫磷檢測的流動相為甲醇︰乙腈=80︰20，對硝基苯酚檢測的流動相為甲醇︰乙腈︰水=48︰42︰10，流速均為1ML/Min，柱溫30℃，進樣量2μL。同時采用甲基對硫磷和對硝基苯酚的標準品繪制樣品濃度與峰面積的標準曲線（R2=0.993 1，R2=0.987 2）。試驗數據均通過SPSS 15.0軟件進行整理分析。

2 結果與分析

2.1 菌株對底物的降解效果

水解圈試驗能夠直觀地反映出微生物對底物的降解能力，不過這一試驗通常局限于有顏色變化或渾濁度變化的底物。從圖1中可以看出，接入YC-YH1后，經過5 d的培養，菌株將底物甲基對硫磷水解成對硝基苯酚，使得菌株周圍出現黃色的水解圈（圖1A）；接入CN2，經過5 d的培養，菌株將培養基中的對硝基苯酚降解，使得原本黃色的培養基變為無色，出現一個透明的水解圈（圖1B）。

圖1 菌株對底物的降解效果（A：Y C-Y H1降解甲基對硫磷形成的水解圈，B：C N2降解對硝基苯酚形成的水解圈）

2.2 降解相關基因的克隆

以YC-YH1基因組為模板對mpd、ophC2和opdA進行PCR擴增，以CN基因組為模板對npdA1與npdA 2進行PCR擴增，結果如圖2所示。由圖2可知，mpd、ophC2、npdA1與npdA2結果為陽性，對獲得的PCR陽性結果產物進行回收、克隆并測序，測序結果進行BLAST比對分析。其中mpd與ophC2基因序列已遞交GenBank并公布，序列分別為KP207597和KP207598，npdA1與npdA2基因序列遞交GenBank但未公布。根據獲得的參與降解的相關基因[17-18]，可以推斷，YC-YH1首先通過mpd與ophC2編碼的有機磷水解酶基因將甲基對硫磷水解為對硝基苯酚與二甲基硫代硫酸酯，CN2進一步通過npdA1、npdA2等編碼的對硝基苯酚降解酶將對硝基苯酚降解，并進入三羧酸循環被微生物所利用。

圖2 降解相關基因的克隆（M∶D N AMa k e r，1：n p d A1，2：n p d A2，3：o ph C2，4：o p d A，5：Mp d）

2.3 YC-YH1與CN2對甲基對硫磷的共降解

菌株YC-YH1與CN2對甲基對硫磷的共降解效果如圖3所示。從圖3A中可以看出，YC-YH1菌株單獨對甲基對硫磷降解時，甲基對硫磷在72 h內被徹底降解；甲基對硫磷降解的同時伴隨著對硝基苯酚的生成，其濃度在16 h后迅速升高，至48 h后達到最高并穩定在42mg/L左右。從圖3B中可以看出，CN2菌株降解對硝基苯酚時，處理64 h后對硝基苯酚就被徹底降解了。從圖3C中可以看出，用YC-YH1和CN2兩種菌株對甲基對硫磷進行共降解時，前期甲基對硫磷降解速率與單獨加入YC-YH1時基本一致；同時，隨著甲基對硫磷的降解，對硝基苯酚生成且濃度逐漸提高，在32 h時達到最大（23.2mg/L），但隨即開始被降解，濃度逐漸下降，在64 h后未檢測到對硝基苯酚。

與YC-YH1單獨降解相比，YC-YH1和CN2共降解在處理的前32 h無較大差異；但之后，甲基對硫磷和對硝基苯酚的降解速度明顯加快，處理48 h后甲基對硫磷即被完全降解，比單獨用YC-H1降解時提前了16 h；而由于CN2菌株的加入，共降解條件下對硝基苯酚的濃度顯著低于同時期YC-YH1單獨降解時對硝基苯酚的濃度，在處理64 h時，對硝基苯酚就被完全降解。

圖3 不同處理對甲基對硫磷或對硝基苯酚的降解曲線（A：Y C-Y H 1對甲基對硫磷的降解曲線以及對硝基苯酚的生成曲線；B：C N2對對硝基苯酚的降解曲線；C：Y C-Y H1與C N2對甲基對硫磷的共降解曲線）

綜上所述，YC-YH1與CN2兩種菌株在共培養條件下，可將甲基對硫磷水解為對硝基苯酚并進一步將對硝基苯酚徹底降解以實現對甲基對硫磷的徹底降解；同時，當體系中對硝基苯酚的濃度較低時，YC-YH1菌株降解甲基對硫磷并未受到明顯影響，而當體系中對硝基苯酚的濃度逐漸升高時，在一定程度上會抑制YC-YH1菌株對甲基對硫磷的降解作用。因此，YC-YH1與CN2共降解不僅實現了對甲基對硫磷的徹底降解，同時還在一定程度上減小了產物反饋對降解過程的抑制作用。

2.4 YC-YH1與CN2在不同土壤中對甲基對硫磷的降解效果

從圖4中可以看出，不同土壤中甲基對硫磷降解速率有一定差異。在滅菌土壤中，甲基對硫磷降解速率相對緩慢，且當甲基對硫磷濃度低于10mg/kg時，殘余的甲基對硫磷很難被徹底降解，始終存在殘留；同時，降解形成的對硝基苯酚在32 h時出現一個最高峰值（23.2mg/kg），隨后濃度逐漸下降，在72 h以后基本穩定在2mg/kg。而在未滅菌土壤中，甲基對硫磷降解速率明顯比在滅菌土壤中的降解速率快，且處理72 h后，甲基對硫磷即被完全降解，而對硝基苯酚產生的趨勢與滅菌土中基本一致，但峰值僅為滅菌土壤中的一半（9.6mg/kg），且在72 h后被徹底降解。在對照組中，甲基對硫磷的濃度下降緩慢，且并未檢測出對硝基苯酚。上述結果表明，在未滅菌的土壤中，土壤中其他微生物可能對甲基對硫磷和對硝基苯酚有一定的協同降解作用。

圖4 不同土壤中YC-YH1與CN2對甲基對硫磷的共降解曲線（A：甲基對硫磷降解曲線，B：對硝基苯酚降解曲線）

3 結論

通常情況下，單一微生物處理很難實現污染物的徹底降解，因此在獲得污染物降解菌構建共降解菌群的同時，穩定降解菌群與土著微生物間的群落結構也非常重要[19-20]。研究通過施氏假單胞菌YC-YH1與節桿菌CN2的共同作用，實現了對甲基對硫磷的徹底降解，同時克隆了mpd、ophC2、npdA 1和npdA 2等參與降解過程的基因，并通過分析推斷了它們在甲基對硫磷降解過程中的作用，最后通過土壤修復試驗初步評估了施氏假單胞菌YC-YH1與節桿菌CN2在甲基對硫磷污染土壤原位修復中的應用潛能。結果表明，在未滅菌土壤中，處理72 h后甲基對硫磷和對硝基苯酚均被完全降解。

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（責任編輯：成 平）

Co-degradation of Methyl Parathion by PseudoMonas stutzeri and Arthrobacter sp.

SHIYan-hua，LEIRen，YANG Jia，YAN Yan-chun
（Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,PRC）

To completely degrademethylparathion,Pseudomonasstutzeri YC-YH1 and Arthrobacter sp.CN2were utilized to co-degrade methyl parathion.Cloning of degrading related geneswas conducted to investigate the degrading mechanism.The results showed that compared to the degradation of YC-YH1 alone,therewere no differences in the first32 h w ith the co-degradation of YC-YH1 and CN2. But later,the degradation velocity of parathion-methyl and p-nitrophenol speeded up obviously,only 48 h later,parathion-methylwas degraded completely,and 64 h later,p-nitrophenol was degraded too.In in situ bioremediation assay,strain YC-YH1 and CN2 could efficiently degrademethyl parathion and the degradation rate of 100 mg/kg methyl parathion in soil was almost 100%in 72 hours, especially in non-sterilized soil.

methyl Parathion,p-nitropehnol,Pseudomonasstutzeri,Arthrobacter sp.co-degradation

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.031

X172

A

1006-060X（2015）04-0097-05

2015-05-09

國家自然科學基金資助項目（31170119）；中國農業科學院基本科研業務基金資助項目 （0042014006，0042012003，0042011006）

史延華（1983-），男，山東臨朐縣人，博士研究生，主要從事環境微生物學研究。

閆艷春