銀納米粒子增強熒光法測定水體中痕量的恩諾沙星

孫雪，張曉輝，邱杰，蔡逸龍，周坤芳，張勇，王萍

分析測試

銀納米粒子增強熒光法測定水體中痕量的恩諾沙星

孫雪1，張曉輝1，邱杰1，蔡逸龍1，周坤芳1，張勇2，王萍1

（1. 溫州醫科大學環境與公共衛生學院，浙江 溫州 325035； 2. 廈門大學環境科學研究中心，福建 廈門 361005）

在實驗條件下建立了水溶液中痕量恩諾沙星的熒光分析方法；在課題組已有工作的基礎上，采用“綠色”化學方法合成了銀納米粒子；研究了所制得的銀納米粒子對水溶液中恩諾沙星熒光行為的影響，并最終建立了水溶液中痕量恩諾沙星的銀納米粒子增強熒光分析方法。

恩諾沙星；熒光行為；銀納米粒子增強熒光

金屬納米材料由于兼具本身固有的物理化學性質和納米尺度的特殊效應，使其在電學、光學、催化、摩擦學、生物材料等諸多領域都具有十分廣泛的應用[1]。已有研究表明，金屬納米結構表面形成的等離子體能夠通過分子附近局域電場的增強使分子的激發光電場得到增強，從而提高分子的激發強度和效率[2]。銀納米粒子因其特有的光電磁性質、催化特性以及在微電子學領域中的潛在應用前景而被廣泛關注，有文獻報道研究了銀納米粒子對熒光物質熒光特性的影響[3,4]。

恩諾沙星（enrofloxacin，ENX）是人工合成的第3代氟喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、殺菌活性強、體內分布廣、抗菌作用獨特、生物利用度高、毒副作用小、無交叉耐藥性等特點[5-7]。但長期應用恩諾沙星所產生的不良反應、畜禽產品中的殘留以及在環境中的生態效應等方面的問題也已引起了廣泛關注[8]。目前對于恩諾沙星的檢測多采用高效液相色譜法（HPLC）或液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）等理化檢測方法，但這些方法所需設備昂貴、操作繁瑣且靈敏度有限[9]。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、方法簡便、重現性好、設備簡單、價格低廉等優點。恩諾沙星具有共軛結構和剛性，適應于熒光分析法進行相關研究。

本文首先在實驗條件下建立了水溶液中痕量恩諾沙星的熒光分析方法，然后在課題組已開展工作的基礎上，采用“綠色”化學方法合成了銀納米粒子[10,11]，并將此銀納米粒子引入到恩諾沙星熒光行為的研究中，初步考察了其對水溶液中恩諾沙星熒光行為的影響，最終建立了水體中痕量恩諾沙星的銀納米粒子增強熒光分析方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

H-7500透射電子顯微鏡（日本日立公司）；制造有限公司）；島津RF-5310型熒光分光光度計（日本島津公司）。

硝酸銀（AR，上海國藥集團化學試劑有限公司）；恩諾沙星（純度為99.6%，中國藥品生物制品檢定所）；葡萄糖（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；氨水（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；β-CD（≥97%，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 銀納米粒子的制備與表征

在課題組已有工作基礎上，以β-CD為穩定劑，葡萄糖為還原劑采用“綠色化學方法”合成了銀納米粒子[8,9]。研究納米顆粒粒徑、粒度分布以及顆粒形狀有多種方法。本實驗直接將銀納米溶液滴在碳膜處理的銅網上，自然晾干后采用透射電子顯微鏡進行直接觀察。

1.3 熒光強度的測定

實驗首先將恩諾沙星的水溶液與銀納米溶液均勻混合，加超純水稀釋，然后立即放入熒光分光光度計中測量其熒光強度。在進行熒光測定時，保持混合液中恩諾沙星的濃度為0.01mg·L-1，所有熒光光譜的獲得均在室溫下進行，測量過程中激發和發射狹縫均保持為5nm。

1.4 考察銀納米粒子對恩諾沙星熒光行為的影響

取適量恩諾沙星母液，分別加入體積分數為0、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、75%、100%的銀納米溶液，再加入適量超純水，配置成一系列10 mL 0.01 mg·L-1的恩諾沙星樣品溶液，然后分別進行熒光檢測。

2 結果與討論

2.1 恩諾沙星熒光分析方法的建立

圖1 恩諾沙星的熒光激發（λem＝446 nm）和發射（λex＝278 nm）譜圖Fig.1 Fluorescence excitation (λem＝446 nm) and emission (λex＝278 nm) spectra of ENX in waters

實驗首先掃描了恩諾沙星水溶液的激發和發射光譜圖（如圖1所示）。由圖1可知，水溶液中恩諾沙星的最大激發（λex）和發射波長（λem）分別為278 nm和446 nm。另外，從圖中可以明顯看出在檢測波長條件下，空白溶液的自發熒光非常弱，不干擾熒光光譜法對恩諾沙星的檢測。因此，實驗考察了不同濃度恩諾沙星的熒光強度，實驗結果表明，恩諾沙星熒光強度隨著溶液濃度的增大而增強。圖 2為根據恩諾沙星濃度與其熒光強度關系所建立的標準工作曲線，實驗結果表明，標準工作曲線的線性擬合方程為y= 11142x+ 21.759，R2值為0.997 8，恩諾沙星溶液濃度在0.001～0.08 mg·L-1范圍內具有良好的線性。檢出限為6.1×10-5mg·L-1相對標準偏差為1.66%，加標回收率的范圍在94%～103%之間。綜合考慮，選擇0.01 mg·L-1的濃度進行后續實驗。

圖2 恩諾沙星的熒光強度隨其濃度的變化曲線Fig.2 Curve of fluorescence intensities of the ENX to the change of its concentration

2.2 銀納米粒子的制備

本實驗制得的銀納米溶液為油黃色溶膠，該銀溶膠在常溫、不避光條件下可以穩定保存2個月以上，而不會發生聚沉現象。且實驗制得的銀納米粒子為類球形，粒徑小且粒度分布范圍窄，分散性好，平均粒徑約為31 nm[10,11]。

2.3 銀納米粒子對恩諾沙星熒光行為的研究

為了考察制得的銀納米粒子對水溶液中恩諾沙星熒光行為的影響，實驗分別考察了不同體積分數的銀納米溶液對恩諾沙星溶液的熒光行為的影響。實驗結果表明，隨著加入銀納米溶液體積的增大，恩諾沙星熒光發射峰的峰型和位置基本沒有發生變化，而熒光強度則呈現先增強后減弱的趨勢，當加入的銀納米溶液體積分數為50%時，恩諾沙星溶液的熒光強度最強，表明制得的銀納米粒子對恩諾沙星水溶液既具有熒光猝滅作用又具有較強的熒光增敏作用（如圖3所示）。由于在銀納米粒子的制備過程中，β-CD只作為保護劑，沒有參加化學反應，因此實驗最后制得的是銀納米粒子和β-CD的混合物。而有文獻報道，由于β-CD的特殊分子結構，其可以作為熒光增敏劑，并且相關研究也越來越多[12,13]。為了消除β-CD對本實驗的干擾，考察了相同實驗條件下β-CD對恩諾沙星水溶液熒光行為的影響。結果表明，不同濃度的β-CD對恩諾沙星水溶液的熒光強度影響也不同，既有增強也有減弱現象（如圖 3所示）。因此，實驗選取加入體積分數為50%的銀納米溶液進行后續實驗。

圖3 不同體積分數的銀納米粒子和β-CD對水溶液中恩諾沙星熒光強度的影響Fig.3 Effect of different volume fraction of silver nanoparticle and β-CD on the fluorescence behaviors of the ENX in water

2.4 銀納米粒子存在下恩諾沙星熒光分析方法建立

圖4 銀納米粒子存在條件下恩諾沙星溶液的熒光強度隨其濃度的變化曲線Fig.4 Curve of fluorescence intensities of the ENX to the change of its concentration in the presence of silver nanoparticle

實驗分別用體積分數為50%的銀納米溶液配制成一系列濃度的恩諾沙星待測液，在λex= 278.0 nm，λem=446nm處測定其熒光強度，并根據恩諾沙星濃度對熒光強度繪制標準工作曲線，線性擬合方程為y = 11227x + 35.367，R2值為0.995 4，待測恩諾沙星溶液濃度在 0.000 1～0.08 mg·L-1范圍內具有良好的線性（如圖 4所示）。其中檢出限為 5.9×10-6mg·L-1，相對標準偏差為1.57%，加標回收率的范圍在102%～107%之間。因此，本實驗中銀納米粒子存在條件下建立的水溶液中恩諾沙星熒光分析方法比不加銀納米粒子時所建方法的最低檢出濃度低約10倍。故采用銀納米粒子增強熒光法所建立的分析方法可以檢測水體中更低濃度的恩諾沙星，因而具有更廣泛的應用價值。

3 結 論

本研究首先在實驗室條件下建立了水溶液中痕量恩諾沙星的熒光分析方法；其次，在課題組已開展工作的基礎上，采用“綠色”化學方法合成了銀納米粒子，并考察了制得的銀納米粒子對水溶液中恩諾沙星熒光行為的影響。

實驗結果表明，銀納米粒子加入體積分數為50%時，對水溶液中恩諾沙星具有最強的增敏效應；最后，建立了水溶液中痕量恩諾沙星的銀納米粒子增強熒光分析方法，此方法比不加銀納米粒子時所建分析方法得到水溶液中恩諾沙星的最低檢出濃度低約10倍。

［1］孫磊, 劉愛心, 黃紅瑩, 陶小軍. 水溶性銀納米顆粒的制備及抗菌性能[J]. 物理化學學報, 2011, 27(3): 722-728.

［2］Lakowicz J R. Radiative decay engineering: Biophysical and bio medical app lications[J].Anal. Biochem., 2001,298:1-24.

［3］王悅輝, 周濟, 王婷. 納米銀與表面吸附熒光素的熒光性能影響[J].光譜學與光譜分析, 2007, 27(8): 1555-1559.

［4］司民真, 武榮國, 張鵬翔. 燃料分子吸附在正、負電性納米銀上的熒光增強及熒光猝滅現象[J]. 化學物理學報, 2002, 15(5): 346-350.

［5］楊紅初. 恩諾沙星的研究進展及其在豬病防治中的應用[J]. 當代畜牧, 2011, 10(2): 44-46.

［6］Bauditz R. Results of clinical studies with Batril in poultry[J]. Vet Med Rev, 1997, 30(2): 130-136.

［7］杜向黨, 連明香, 陳玉霞. 恩諾沙星聚合物膠束的制備及體外釋放[J]. 中國獸醫學報, 2012, 32(3): 432-436.

［8］Maurerc C, Meunier D, Madec J Y, et a1. Shiga toxin Stx2 production is promoted by enrofloxacin in experimental in vitro-selected mutants of Escherichia coli O157: H7 resistant to fluoroquinolones[J]. Foodborne Pathog Dis, 2009, 6(2): 257-259.

［9］趙莉莉, 黃飚, 王曉嵐. 恩諾沙星時間分辨熒光免疫分析方法的建立[J]. 食品科學, 2011, 32(10): 110-114.

［10］李毓騏, 朱亞先, 張勇. 銀納米粒子的綠色合成及其對熒光素室溫磷光的增強效應[J]. 高等學校化學學報, 2008, 29(4): 669-672.

［11］鄧樹明, 鄒玉杰, 王學東, 等. 銀納米粒子抗生素諾氟沙星的熒光猝滅效應[J]. 光譜實驗室, 2012, 29(1): 16-20.

［12］趙永福, 張志, 黃志強. β-環糊精增敏熒光法快速測定蔬菜中有機磷農藥殘留[J]. 分析測試技術與儀器, 2009, 15(4): 233-237.

［13］許金鉤,編. 熒光分析法[M]. 北京:科學出版社, 2006: 52-55.

A Silver Nanoparticle-Enhanced Fluorimetry for Determination of Trace Enrofloxacin in Water

SUN Xue1, ZHANG Xiao-hui1, QIU Jie1, CAI Yi-long1, ZHOU Kun-fang1, ZHANG Yong2, WANG Ping1*
（1. School of Environmental Science and Public Health, Wenzhou Medical University, Zhejiang Wenzhou 325035, China；2. Department of Environmental chemistry, Xiamen University, Fujian Xiamen 361005, China）

Firstly, a fluorimetry for determination of trace enrofloxacin in water was established in laboratory conditions. Secondly, the silver nanoparticle was synthesized based on our previous studies. In addition, effect of silver nanoparticle on the fluorescence behavior of enrofloxacin in water was investigated. Finally, a silver nanoparticle-enhanced fluorimetry for determination of trace enrofloxacin in water was also established.

Enrofloxacin; Fluorescence behavior; A silver nanoparticle-enhanced fluorimetry

O 657

： A

： 1671-0460（2015）04-0855-03

國家自然科學基金項目，項目號：21207103；浙江省大學生科技創新活動計劃暨新苗人才計劃，項目號：2013R413010；浙江省公益項目，項目號：2012C31025)。

2014-11-14

孫雪，女，山東濟南人，研究方向：有機污染物的分析方法研究。E-mail：1026033690@qq.com。

王萍（1981-），女，副教授，博士，研究方向：有機污染物的遷移轉化行為研究。E-mail：wangping_xmu@163.com。