紫葉李果實的化學成分研究

李曉男，陳燕燕，周江韜，王躍飛，姜苗苗*

1 天津市現代中藥重點實驗室天津中醫藥大學，天津 300193;2中藥新藥研發中心天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457

紫葉李(Pranus cerasifera Ehrh f.)又名紅葉李，櫻桃李，薔薇科(Rosaceae)李屬植物。紫葉李是落葉小喬木，葉常年紫色，著名觀葉樹種。原種產于亞洲西南部，具有耐濕，耐寒和一定的耐堿能力，因我國天津市濱海新區冬季寒冷干燥，夏季酷熱潮濕，土壤鹽分高，易旱，所以紫葉李在濱海新區得以廣泛種植［1］。國內外學者對紫葉李同屬植物的化學成分進行了報道，從它們的葉子、果實、種子等部位分離得到黃酮類、花色素類、香豆素類、新木脂素類等成分［2-5］。現在，隨著對紫葉李的不斷研究，已有文獻報道紫葉李的葉子具有抗氧化活性［6］，但是對紫葉李果實的化學成分研究甚少。

本文對紫葉李的新鮮果實進行化學成分研究，分離得到5 種化合物，分別為3-O-乙酰基原兒茶酸(1)、2(R)-羥基丁二酸-1-甲酯(2)、3，3'，4，4'-四羥基聯苯(3)、β-胡蘿卜苷(4)和槲皮素(5)。化合物1～4 為首次從該植物中分離得到，其中，1 為新天然產物。

1 儀器與材料

Bruker PLUS 400 MHz 核磁共振波譜儀;Bruker AVANCE Ⅲ600 MHz 核磁共振波譜儀;Waters TQ-S質譜儀，Waters Xevo G2-S Q-TOF MS 質譜儀;旋轉蒸發儀RE-52A(上海亞榮生化儀器廠);薄層層析硅膠GF-254、柱層析硅膠200～300 目(青島海洋化工廠)，ODS-A-HG 5～50 μm(日本YMC 公司)，Sephadex LH-20 凝膠(瑞士GE Healthcare 公司)，DPPH(2，2-二苯基-苦肼基，Sigma 公司)，維生素C(天津市北方天醫化學試劑廠)，96 微孔板(美國Corning 公司);所用試劑均為分析純(天津康科德試劑公司)。

紫葉李果實，2013 年9 月采集于天津市濱海新區，由天津中醫藥大學吳紅華博士鑒定為薔薇科李屬植物紫葉李(Pranus cerasifera Ehrh f.)的新鮮果實。標本(B41320090001)存放于天津中醫藥大學中藥新藥研發中心化學與分析部。

2 提取與分離

將紫葉李果實在60 ℃恒溫干燥箱中干燥，稱重得2.0 kg，粉碎。用10 倍量的95%乙醇冷浸兩次，每次7 d，將所得提取液合并過濾，減壓濃縮至無醇味，得乙醇提取物800 g。將乙醇提取物用蒸餾水混懸均勻后依次用等體積乙酸乙酯，萃取3 次，合并萃取液，得到乙酸乙酯部位85 g。將乙酸乙酯部位經硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(v/v，二氯甲烷，100∶2，100∶3，100∶6，100∶10，100∶25，100∶50，甲醇)梯度洗脫得到8 個餾份(Fr.1～8)。Fr.2 經硅膠柱，得到亞餾分Fr.2.1 和Fr.2.2。Fr.2.1 經Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇=1∶1，v/v)純化，得到化合物2(5 mg)、3(10 mg)。Fr.2.2 經硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇(100∶3，v/v)洗脫得到Fr.2.2.1，經Sephadex LH-20(甲醇∶水=1∶1，v/v)反復純化，得到化合物5(3 mg)。Fr.3 經硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(100∶2，v/v)洗脫，得到Fr.3.1，再經硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(100∶5，v/v)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇∶水=1∶1，v/v)純化，得到化合物1(25 mg)。Fr.4 經硅膠柱色譜和ODS 純化，得到化合物4(20 mg)。

3 結構鑒定

化合物1 黃色針狀晶體(甲醇);ESI-MS m/z:374［2M-H2O］+，195［M-H］-，ESI-MS2給出離子峰［M-H-60］-，中性失去60，提示結構中存在一分子乙酰 氧 基;HR-ESI-MS m/z:195.0294［M-H］-(C9H7O5，計算值為195.0293)，確定其分子式為C9H8O5，不飽和度為5;UV(MeOH)λmax(log ε):292(0.29)nm;IR(KBr)νmax3210，2654，1697，1603，1528，1297，1098，943，766，640 cm–1;在1H NMR(CD3OD，400 MHz)中，由δ 7.43(overlapped)，δ 7.41(1H，d，J=2.1Hz，H-2)和δ 6.80(1H，d，J=8.5Hz，H-5)提示化合物1 中存在一個1，3，4-三取代苯環，δ 2.56(3H，s，-CH3)提示化合物1 存在-CH3。在13C NMR(CD3OD，100 MHz)中顯示9 個碳原子信號，其中δ 176.0，δ 169.1 為羰基碳原子信號，δ 150.5、δ 144.0、δ 122.7、δ 121.8、δ 116.3、δ 114.7 為芳香區碳原子信號，δ 29.8 為-CH3中碳原子信號。從HMBC 圖譜中可以看到-CH3(δ 2.56)與C-1'(δ 176.0)相關，提示結構中含有一個乙酰基;另外δ 7.43(overlapped)、δ 7.41(H-2)與δ 169.1(C-7)相關，說明苯環上H-1 位置被羧基取代;通過對比化合物1 和原兒茶酸標準品的1H NMR和13C NMR 數據，發現C-3 化學位移存在差異，化合物1 的C-3 的比原兒茶酸的C-3 向高場移動δ 2.1，提示乙酰基將原兒茶酸中的C-3 位的酚羥基乙酰化，得到的乙酰化產物為化合物1，其結構與文獻［7］一致，即化合物1 為3-O-乙酰基原兒茶酸(3-O-acetyl-protocatechuic acid)。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.43(overlapped)，7.41(1H，d，J=2.1Hz，H-2)，6.80(1H，d，J=8.5Hz，H-5)，2.56(3H，s，-CH3);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:176.0(C-1')，169.1(C-7)，150.5(C-4)，144.0(C-3)，122.7(C-6)，121.8(C-1)，116.3(C-2)，114.7(C-5)，29.8(C-2')。其化學結構見圖1。

圖1 化合物1 的化學結構和HMBC 相關Fig.1 Chemical structure and key HMBC correlations of compound 1

化合物2 無色結晶(甲醇);分子式C5H8O5;ESI-MS m/z:149［M+H］+，147［M-H］-;在1H NMR(CD3OD，600 MHz)中由δ 4.50(1H，dd，J=7.3，4.7 Hz)上偶合常數判斷為叔碳上的質子信號。δ 3.74(3H，s)為-OCH3上的質子信號，δ 2.67(1H，dd，J=16.2，7.3 Hz)，δ 2.78(1H，dd，J=16.2，4.6 Hz)則為-CH2信號。13C NMR(CD3OD，100 MHz)顯示6 個碳原子信號，其中δ 175.1、δ 174.1為兩個羰基碳原子信號;δ 68.5、δ 39.8 由化學位移判斷為相連的叔碳和仲碳原子信號;δ 52.6 則為-OCH3上碳原子信號。1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ 4.50(1H，dd，J=7.3，4.7 Hz)，3.74(3H，s，-OCH3)，2.78(1H，dd，J=16.2，4.6 Hz)，2.67(1H，dd，J=16.2，7.3 Hz);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:175.1(C-1)，174.1(C-4)，68.5(C-2)，52.6(-OCH3)，39.8(C-3)。以上數據與文獻［8］報道基本一致，故化合物2 鑒定為2(R)-羥基丁二酸-1-甲酯(2(R)-hydroxybutanedioic acid-1-methyl ester)。

化合物3 白色粉末(甲醇);分子式C7H6O4;ESI-MS m/z:435［2M-H］-，217［M-H］-;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:6.97(1H，d，J=2.0Hz，H-2)，6.86(1H，dd，J=2.0，8.4Hz，H-6)，6.79(1H，d，J=8.4，H-5);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:146.3(C-4，4')，145.2(C-3，3')，134.8(C-1，1')，118.9(C-6，6')，116.5(C-5，5')，114.6(C-2，2')。以上數據與文獻［9］報道基本一致，故化合物3 鑒定為3，3'，4，4'-四羥基聯苯(3，3'，4，4'-Tetrahydroxybiphenyl)。

化合物4 白色粉末(甲醇);分子式C35H60O6;10%硫酸乙醇溶液顯紫紅色;其1H NMR 和13C NMR譜與胡蘿卜苷標準譜一致，故化合物4 鑒定為β-胡蘿卜苷(β-daucosterol)。

化合物5 黃色針狀晶體(甲醇);分子式為C15H10O7;ESI-MS m/z:303［M+H］+，301［M-H］-;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.72(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.61(1H，dd，J=2.0，8.4 Hz，H-6')，6.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-5')，6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.16(1H，d，J=2.0 Hz，H-6);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:177.4(C-4)，165.7(C-7)，162.6(C-5)，158.2(C-9)，148.8(C-2)，148.0(C-4)，146.3(C-3')，137.3(C-3)，124.2(C-1')，121.7(C-6')，116.3(C-5')，116.0(C-2')，104.5(C-10)，99.3(C-6)，99.4(C-8)。以上數據與文獻［10］報道基本一致，故化合物5 鑒定為槲皮素(Quercetin)。

4 抗氧化活性測定

待測的5 個化合物對DPPH 自由基的清除作用，按文獻［11］方法測定。待測化合物清除DPPH 自由基的IC50值如下表1 所示。結果顯示化合物3、5清除DPPH 自由基的能力與Vc 相當，與它們的化學結構中含有較多的酚羥基數目有關。

表1 待測化合物清除DPPH 自由基的IC50值Table 1 IC50of DPPH scavenging of the isolated compounds

1 Wei J(魏劍)，Wang SJ(王素君).The ecological landscaping plants configuration of Tianjin Binhai new area.Sci Technol Tianjin Agric Forest(天津農林科技)，2011，5:26-28.

2 Wu B(吳波)，Zhang WN(張維農)，Yan JF(嚴建芳)，et al.Optimum extraction technology of kaempferol in Prunus cerasifera leaves.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2011，23:952-955.

3 Koestsu T，Youhei T，Hiroya O，et al.Variation of fragrance constituents in the leaves of Prunus.Biochem Syst Ecol，2006，34:127-135.

4 Farnk SS，Santamour J，Louisse GH，et al.Distribution and inheritance of scopolin and herniarin in some Prunus species.Biochem Syst Ecol，1994，22:197-201.

5 Liu QB，Huang XX，Yan XJ，et al.Neolignans from the seeds of Prunus tomentosa(Rosaceae)and their chemotaxonomic interest.Biochem Syst Ecol，2014，55:236-240.

6 Hu YF(胡迎芬)，Meng J(孟潔)，Hu BL(胡博璐).An-tioxidant activity and stability of the exact of Pranus cerasifera Ehrh Cv.Food Sci(食品科學)，2002，23:274-276.

7 Schuster B，Winter M，Herrmann K.4-O-β-D-Glucosides of hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acids-their synthesis and determination in berry fruit and vegetables.J Biosciences，1986，41c:511-520.

8 He XJ，Liu RH.Cranberry phytochemicals:Isolation，structure elucidation，and their antiproliferative and antioxidant activities.J Agric Food Chem，2006，54:7069-7074.

9 Fu C(付琛)，Chen C(陳程)，Zhou GX(周光雄)，et al.Chemical constituents from fruits of Amomum villosum.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2011，42:2410-2412.

10 Young HC，Hye KK，Huub JM，et al.NMR metabolomics to revisit the tobacco mosaic virus infection in Nicotiana tabacum leaves.J Nat Prod，2006，69:742-748.

11 Cai YZ，Sun M，Xing J，Luo Q，et al.Structure-radical scavenging activity relationships of phenolic compounds from traditional Chinese medicinal plants.Life Sci，2006，78:2872-2888.