近紅外光譜法快速測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量

張迪文，白 雁，謝彩俠，胡小莉，郝 敏，謝惠英

河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州 450046

女貞子(Fructus Ligustri Lucidum)是木犀科植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的干燥成熟果實(shí)，是一味傳統(tǒng)的扶正固本藥物，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)之功效［1］。臨床主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥［2］。女貞子含有多種化學(xué)成分，最先發(fā)現(xiàn)的是含有較高含量的齊墩果酸、乙酰齊墩果酸、熊果酸等［3］。2010 年版《中國(guó)藥典》收載的女貞子藥材的標(biāo)準(zhǔn)是以高效液相色譜法測(cè)定特女貞苷含量。供試品的制備要經(jīng)過(guò)精密稱定，加熱回流，補(bǔ)足失重等多個(gè)步驟，處理過(guò)程較為繁瑣復(fù)雜。

近紅外光譜技術(shù)結(jié)合了光譜衡量技術(shù)、化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)和基礎(chǔ)測(cè)量技術(shù)，能夠快速、高效、無(wú)損的對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析［4-6］。近紅外光譜技術(shù)通過(guò)對(duì)樣品一次測(cè)定，就可以在幾秒至幾分鐘內(nèi)同時(shí)測(cè)定一個(gè)樣品的幾種至十幾種性質(zhì)數(shù)據(jù)［7］。本文對(duì)女貞子藥材中指標(biāo)性成分特女貞苷的含量做了相關(guān)研究，并利用近紅外光譜技術(shù)上述優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合偏最小二乘法建立女貞子藥材中特女貞苷含量的定量分析模型，為女貞子藥材的質(zhì)量檢測(cè)與分析評(píng)價(jià)提供了快捷簡(jiǎn)便的新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nicolet 6700 型傅里葉變換近紅外光譜儀(配有InGaAs 檢測(cè)器，50 mL 標(biāo)準(zhǔn)石英樣品杯，漫反射積分球，樣品旋轉(zhuǎn)器以及OMNIC 光譜采集軟件，TQ Analyst 8.0 分析軟件，美國(guó)Thermo 公司)，SZ-93 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，F(xiàn)W-200型高速藥材粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，101A-2B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)，METTLER TOLEDO AL204 型1/萬(wàn)分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，HS-6150 型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

女貞子藥材為采購(gòu)于四川、湖南、浙江、河南4個(gè)產(chǎn)地共91 份樣品，由河南中醫(yī)學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為木犀科女貞屬植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的干燥成熟果實(shí)。

乙醇、蒸餾水均為分析純，甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 近紅外光譜的采集

取上述91 份樣品適量，粉碎，過(guò)40 目篩，取約5 g 粉末裝入石英杯，混合均勻，采用積分球漫反射，以空氣為參比，扣除背景采集光譜圖。采集參數(shù)如下:分辨率8 cm-1，光譜采集范圍12000～4000 cm-1，掃描次數(shù)64 次，每次掃描背景間隔20 min。溫度25～28 ℃，相對(duì)濕度17%～20%。每份樣品重復(fù)掃描3 次，求平均光譜，91 份樣品的近紅外光譜疊加圖見(jiàn)圖1。

圖1 91 份女貞子的近紅外原始光譜疊加圖Fig.1 The overlaid near-infrared reflectance spectra of 91 samples

2.2 特女貞苷參考值的HPLC 測(cè)定

參照2010 年版《中國(guó)藥典》一部中女貞子項(xiàng)下特女貞苷的HPLC 含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用的色譜條件:Dikma Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇-水(40∶60)，柱溫:30 ℃，進(jìn)樣量:10 μL，流速:1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):224 nm。以保留時(shí)間定性，峰面積定量，外標(biāo)法計(jì)算。每份樣品平行測(cè)定兩次，計(jì)算平均值，并以其作為參考值，女貞子藥材中特女貞苷的含量結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 91 份女貞子藥材中特女貞苷含量Table 1 The content of specnuezhenide in 91 samples

2.3 建立特女貞苷近紅外定量分析模型

2.3.1 校正集和驗(yàn)證集樣品的選擇

根據(jù)女貞子藥材中特女貞苷含量分布情況，從91 份樣品中選取71 份具有代表性的樣品組成校正集，用于建立近紅外模型;其余20 份樣品組成驗(yàn)證集，對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。校正集與驗(yàn)證集的選擇原則為驗(yàn)證集的特女貞苷含量分布范圍應(yīng)在校正集的特女貞苷含量分布范圍之內(nèi)。表2 為校正集和驗(yàn)證集樣品的特女貞苷含量的分布范圍。

表2 校正集與驗(yàn)證集樣品的特女貞苷含量分布范圍Table 2 The content distribution of calibration set and validation set for specnuezhenide content

2.3.2 光譜預(yù)處理方法的選擇

在建立近紅外定量分析模型前，首先要對(duì)樣品的近紅外原始吸收光譜進(jìn)行預(yù)處理，為了消除光譜噪音、顆粒散射、光譜漂移等非線性因素對(duì)定量結(jié)果的影響。常用的預(yù)處理方法有多元散射校正法(MSC)，標(biāo)準(zhǔn)歸一化法(SNV)，一階導(dǎo)數(shù)法(First derivative)，二階導(dǎo)數(shù)法(Second derivative)，Savitzky-Golay 濾波法，Norris derivative 濾波法［8］等。表3為使用不同的預(yù)處理方法后，校正集內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(R2)、校正均方差(RMSEC)及驗(yàn)證集預(yù)測(cè)均方差(RMSEP)的比較。其中，R2越接近1 模型越好，真實(shí)值和預(yù)測(cè)值相關(guān)性越好;RMSEC 和RMSEP越小且越接近越好，所建模型的適用性越強(qiáng)，預(yù)測(cè)結(jié)果越準(zhǔn)確［9］;同時(shí)，要保證RMSEC 應(yīng)小于RMSEP，否則會(huì)出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以SNV+SD+ND 預(yù)處理效果最好，可以消除樣品光譜噪音以及漂移所造成的影響，強(qiáng)化樣品近紅外光譜的譜帶特征，并克服樣品譜帶重疊的現(xiàn)象，因此選用此法為光譜預(yù)處理的最佳方法。

表3 不同預(yù)處理方法對(duì)定量模型性能的影響Table 3 The effects of different pretreatment methods on quantitative model performance

SNV+SD+ND 最佳光譜預(yù)處理方法處理后得到的近紅外光譜見(jiàn)圖2。

圖2 預(yù)處理后的近紅外光譜Fig.2 The near-infrared reflectance spectra after pretreatment

2.3.3 建模波段的選擇

在建立模型時(shí)需要不斷地選擇波段范圍以調(diào)整模型的準(zhǔn)確性，以R2和RMSECV 為指標(biāo)，其中，R2越接近1，RMSECV 越小，模型越好。采用最佳預(yù)處理方法，即SNV+SD+ND，對(duì)不同的波段進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化比較，選擇最佳波段范圍。結(jié)果見(jiàn)表4，在波段區(qū)間4007.35～9987.74 cm-1，R2最接近1，RMSECV最小，故此波段選為最佳建模波段。

表4 不同光譜范圍對(duì)R2 和RMSECV 的影響Table 4 The effects of different spectral range on R2 and RMSECV

2.3.4 主成分?jǐn)?shù)的選擇

在建模過(guò)程中，采用不同的主成分?jǐn)?shù)，模型的預(yù)測(cè)能力不同，主成分?jǐn)?shù)太多，模型包含過(guò)多的測(cè)量噪音，校正過(guò)程會(huì)出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象;主成分?jǐn)?shù)太少，建模信息不全，預(yù)測(cè)能力差［11］。采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證考察主成分?jǐn)?shù)對(duì)內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差(RESECV)的影響，RESECV 隨主成分?jǐn)?shù)變化的曲線見(jiàn)圖3。從圖中可以看出，當(dāng)偏最小二乘法因子數(shù)為7 時(shí)，RESECV 最小，為最佳建模主成分?jǐn)?shù)。

圖3 主成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV 的影響Fig.3 The RMSECV value with different factors for specnuezhenide

2.4 定量模型的建立

運(yùn)用TQ Analyst8.0 分析軟件，91 份樣品進(jìn)行建模，對(duì)光譜采用SNV+SD+ND 預(yù)處理方法，在4007.35～9987.74 cm-1波段范圍，7 個(gè)主成分?jǐn)?shù)進(jìn)行建模。用校正集樣品進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，R2為0.98075，RMSEC 為0.216，RMSEP 為0.223，RMSECV 為0.52276。特女貞苷的NIR 預(yù)測(cè)值與HPLC參考值的相關(guān)圖見(jiàn)圖4，偏差圖見(jiàn)圖5，可以看出預(yù)測(cè)值與參考值的相關(guān)性較高，且結(jié)果很接近，模型的性能較好，該模型可以用于女貞子藥材中特女貞苷的定量分析。

圖4 特女貞苷NIR 預(yù)測(cè)值與HPLC 參考值的相關(guān)圖Fig.4 Correlation between NIR predicted and reference values for specnuezhenide

2.5 定量模型的驗(yàn)證

圖5 特女貞苷NIR 預(yù)測(cè)值與HPLC 參考值的偏差圖Fig.5 Deviation between NIR predicted and reference values for specnuezhenide

為評(píng)價(jià)模型的實(shí)際預(yù)測(cè)效果，將20 份驗(yàn)證集樣品的近紅外光譜輸入所建定量模型中，預(yù)測(cè)其特女貞苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。驗(yàn)證集的最大絕對(duì)誤差為0.35%，最小絕對(duì)誤差為0.00%，相對(duì)誤差均不超過(guò)5.83%，平均相對(duì)誤差為2.83%。由此可見(jiàn)NIR 預(yù)測(cè)值與HPLC 參考值非常接近，該定量分析模型準(zhǔn)確可靠，預(yù)測(cè)能力較好，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)相應(yīng)范圍內(nèi)女貞子藥材中特女貞苷的含量。

表5 20 份驗(yàn)證集樣品的近紅外定量模型預(yù)測(cè)值Table 5 NIR predicted values of 20 validation set

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用2010 年版《中國(guó)藥典》一部中女貞子項(xiàng)下特女貞苷的HPLC 含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)每份樣品平行重復(fù)測(cè)定2 次，取2 次測(cè)定結(jié)果的平均值作為建立近紅外定量分析模型的NIR 參考值，可以保證所建模型的準(zhǔn)確性。

近紅外定量分析模型的適用范圍取決于校正集樣品指標(biāo)性成分的含量范圍。本實(shí)驗(yàn)收集到的女貞子藥材來(lái)自浙江、湖南、河南、四川等多個(gè)產(chǎn)地，涵蓋范圍較廣且分布較為均勻，具有一定的代表性。因此，所建模型適用性較強(qiáng)，可用于女貞子藥材中指標(biāo)性成分特女貞苷的含量預(yù)測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法建立了一種快速測(cè)定女貞子藥材中特女貞苷含量的新方法，該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，快速無(wú)污染。相比2010年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定采用高效液相色譜法對(duì)女貞子中特女貞苷進(jìn)行含量測(cè)定，雖然HPLC 的測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但是其前處理繁瑣復(fù)雜，且化學(xué)試劑污染空氣環(huán)境，測(cè)定過(guò)程較長(zhǎng)。反觀近紅外光譜技術(shù)，分析速度快，獲得信息多，簡(jiǎn)便快捷，非破壞性分析等優(yōu)點(diǎn)使其成為一種“綠色”分析技術(shù)，測(cè)定過(guò)程不用化學(xué)試劑、不污染環(huán)境，真正實(shí)現(xiàn)“綠色”檢驗(yàn)，節(jié)約檢測(cè)成本，將會(huì)在中藥制藥行業(yè)發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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