玄參飲片質量控制方法研究

賈成友，張傳輝，趙鳳平，傅 亞，王云紅*，楊榮平*

1 成都中醫藥大學藥學院，成都 611137;2 重慶市中藥研究院，重慶 400065;3重慶科技學院化學化工學院，重慶 401331

玄參系玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效，主產于浙江、四川、湖北、安徽、江蘇等地。玄參藥用歷史悠久，栽培地區廣泛，具有多種類型的種質［1］，且炮制方法多樣，具有凈制、切制、單純加熱制、輔料制等［2］。2010 年版《中國藥典》(一部)規定玄參飲片中哈巴苷和哈巴俄苷的總量不得少于0.45%［3］，鑒于中藥成分的復雜性，多指標成分同時測定也并非能將所有活性成分定量。因此，本研究在測定16批重慶市售玄參飲片中哈巴苷和哈巴俄苷含量的基礎上，對其合格者進行了指紋圖譜研究［4-7］，并采用聚類分析(Cluster analysis)、主成分分析(Principal component analysis)等方法［8-10］探究重慶市售玄參飲片質量情況，以期為玄參飲片質量控制和標準提升提供更好的技術手段和科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

20A 系列HPLC 儀(配備二元泵，在線脫氣，DAD 檢測器，自動進樣器，柱溫箱，日本島津公司)，CPA 225D 型電子天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)，BS 224S 型電子天平(萬分之一，德國Sartorius 公司)，DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

哈巴苷(批號FY12871128)、哈巴俄苷(批號FY12861116)對照品購自南通飛宇生物科技有限公司，肉桂酸(批號110786-200503)對照品購自中國藥品生物制品檢定所，所有對照品經HPLC 峰面積歸一化法檢測純度均高于98%，乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸、冰醋酸為分析純，水為自制超純水。

1.2 樣品來源

玄參飲片購于重慶桐君閣中藥批發商及桐君閣藥房、萬鑫藥房、和平藥房、康濟大藥房等各大藥店，經重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。

1.3 實驗方法

1.3.1 一測多評法測定肉桂酸、哈巴苷和哈巴俄苷的含量

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱:Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～10 min，3%B;10～20 min，3%～22%B;20～60 min，22%B;60～70 min，22%～3%B，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫35℃。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取經五氧化二磷干燥10 h 的肉桂酸、哈巴俄苷和哈巴苷對照品適量，加30%甲醇制成每1 mL 含肉桂酸4.098 μg、哈巴俄苷9.6 μg、和哈巴苷58.2 μg 的混合對照品溶液，即得。

1.3.1.3 供試品溶液的制備

取玄參藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

筆者在前期研究中已建立采用HPLC 法同時測定玄參藥材及飲片中哈巴苷和哈巴俄苷含量的一測多評評價模式［11］，鑒于已另文發表，這里僅作簡要闡述:以肉桂酸為內標物質，按照公式fs/k=fs/fk=(Cs×Ak)/(Ck×As)(式中CS為內標物濃度，AS為內標物峰面積，Ck為待測成分對照品k 的濃度，Ak為待測成分對照品k 的峰面積)計算得到肉桂酸對哈巴苷和哈巴俄苷的校正因子(RCF)分別為f肉桂酸/哈巴苷=0.0607，f肉桂酸/哈巴俄苷=0.3040。精密吸取肉桂酸系列濃度對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品質量(X，μg)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=6465700X-4021.3(r=0.9999)，線性范圍0.008196～0.122940 μg，結果表明，肉桂酸在相應范圍內線性關系良好。

1.3.2 玄參飲片指紋圖譜分析

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱:Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:1%冰醋酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，0～20 min，5%～30%B;20～40 min，30%～45%B;40～50 min，45%～65%B;50～60 min，65%～100%B;進樣量10 μL，檢測波長290 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃。

1.3.2.2 對照品溶液的制備

對照品溶液的制備方法同“1.3.1.2”。

1.3.2.3 供試品溶液的制備

取玄參藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)60 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.3.2.4 精密度試驗

精密吸取同一份供試品溶液10 μL，連續進樣6次，依法測定，記錄峰面積。結果以肉桂酸峰的保留時間和峰面積為對照，各共有峰的相對保留時間和峰面積比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指紋圖譜技術的要求，表明儀器精密度良好。

1.3.2.5 穩定性試驗

分別于0、4、8、12、24、36 h，精密吸取同一份供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，記錄峰面積。結果以肉桂酸峰的保留時間和峰面積為對照，各共有峰的相對保留時間和峰面積比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指紋圖譜技術的要求，表明供試品溶液在36 h 內穩定。

1.3.2.6 重復性試驗

取同一批次的玄參藥材粉末(過三號篩)6 份，每份約0.5 g，依法制備供試品溶液，分別進行測定，記錄峰面積。結果以肉桂酸峰的保留時間和峰面積為對照，各共有峰的相對保留時間和峰面積比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指紋圖譜技術的要求，表明本方法穩定，可靠，具有較好的重復性。

1.3.2.7 耐用性試驗

分別考察一定范圍內流動相梯度、柱溫、檢測波長、流速變化，以及采用3 根不同的色譜柱Inertsustain C18、Waters C18、Diamonsil C18(均為4.6 mm×250 mm，5 μm)進行測定對儀器色譜行為變化的影響，結果各條件下所測各主要色譜峰相對保留時間RSD 在0.812%～2.671%之間，相對峰面積比值RSD 在0.99%～2.74%之間，表明本方法具有較好的耐用性。

1.3.3 聚類分析［8］

根據指紋圖譜分析結果，將篩選出的11 批玄參飲片主要共有峰面積導入SPSS 19.0 軟件，采用歐式距離平方、組間平均連接法對11 批飲片進行聚類分析。

1.3.4 主成分分析［9，10］

將11 批重慶市售玄參飲片指紋圖譜中所確定的主要共有峰面積導入SPSS 19.0 軟件，依法分析，取特征值較為明顯的兩個組成分(方差貢獻率≥60%)的得分做向量圖，進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 16 批玄參飲片中肉桂酸、哈巴苷和哈巴俄苷的含量測定

采用所建立的一測多評法對所購16 批玄參飲片中哈巴苷和哈巴俄苷含量進行測定，結果見表1。

表1 玄參飲片中哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量Table 1 The contents of harpagide，cinnamic acid and harpagoside in R.scrophulariae pieces

由表1 可知，16 批玄參飲片中只有11 批滿足2010 年版《中國藥典》(一部)玄參飲片含量測定項下要求，將合格飲片依次標為S1～S11 表示。可見，合格飲片中哈巴苷、肉桂酸和哈巴俄苷含量均高于不合格者，表明通過指標成分控制飲片質量具有一定的可行性。但合格玄參飲片中哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量及哈巴苷哈巴俄苷總含量的RSD 分別為34.22%、52.42%、47.53%、13.41%，表明不同飲片間哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量的RSD 差異較大，僅通過指標成分的方法控制藥材的質量具有一定的局限性，并非可以反映所有活性成分的信息。

因此，研究擬將一測多評含量測定技術相和指紋圖譜技術相結合，用于玄參飲片質量控制和評價，旨在進一步探索玄參質量標準提升的科學方法。

圖1 玄參飲片HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for 11 batches of R.scrophulariae pieces

2.2 玄參的指紋圖譜分析

2.2.1 指紋圖譜的建立及相似度評價

按照所建立的方法，以肉桂酸為參照物，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004 A 版(國家藥典委員會)軟件對11 批合格玄參飲片進行指紋圖譜測定，所得HPLC 指紋圖譜及生成的玄參飲片對照指紋圖譜見圖1、圖2，相似度計算結果見表2。

圖2 玄參飲片對照指紋圖譜Fig.2 Typical fingerprint of R.scrophulariae pieces

表2 相似度計算結果Table 2 Results of Similarity calculation

2.2.2 共有特征峰的標定與色譜峰歸屬

對各批飲片進行特征圖譜分析，共標定了53 個共有峰，確定了18 個主要共有指紋峰，峰面積結果見表3。指定了其中7 個指紋圖譜共有峰，并對1、5、7 號色譜峰進行指認，分別為哈巴苷，肉桂酸和哈巴俄苷。

表3 玄參飲片指紋圖譜共有峰峰面積Table 3 Peak area of common peaks in fingerprint of R.scrophulariae pieces

經指紋圖譜分析發現，11 批玄參飲片相似度在0.731～0.960 之間，除S11 相似度為0.731 外，其余10 批次飲片整體上具有良好的相似性。然而，18個主要共有峰面積RSD 在12.5%～107.5%之間，非共有峰面積的比例在21.7%～41.4%之間，表明不同批次玄參飲片的化學成分種類和含量均存在一定的差異性，藥材質量參差不齊，僅僅利用相似度及峰面積RSD 等方法無法全面客觀地體現飲片之間存在的差異性和一致性。因此，擬采用CA 和PCA相結合的方法對11 批飲片進行共有模式識別研究。

2.3 聚類結果分析

采用上文方法，將18 個主要共有峰面積導入SPSS 19.0 軟件進行聚類分析，結果如圖3 所示。

圖3 聚類分析結果Fig.3 Results of cluster analysis

由圖3 可知，以α 線為界，飲片可聚類為3 類:I(S1、S10、S2、S8、S3、S5)，II(S4、S6、S9、S7)，III(S11)。其中，S1、S10、S2 與S8 聚為一類后又與S3、S5 聚為一類，表明飲片S1、S10、S2、S8、S3、S5 之間具有一定的統一性;I 類中，S1、S10、S2 聚為一類，S3、S5 聚為一類，S8 單獨聚為一類，表明同一類別中飲片又存在一定的差異性。同樣，S4、S6 與S9聚為一類后又與S7 聚為一類形成II，說明它們之間既有一定的統一性又存在一定的差異性。以β 線為界，飲片可聚類為2 類，S11 被單獨的分為一類(產地為浙江，其他飲片均來自川渝地區)，其余樣品被聚為另一類。根據前文計算結果，S11 中哈巴苷與哈巴俄苷總含量為0.549%，高于S1、S2、S7、S8、S10，但與對照指紋圖譜比較相似度為僅為0.731，表明通過指標成分控制藥材質量具有局限性，不同產地的飲片之間存在著較大的地域性差異，聚類分析對玄參進行化學模式識別具有一定的科學道理。

2.4 主成分結果分析

采用上文方法，將18 個主要共有峰面積導入SPSS 19.0 軟件，取特征值較為明顯的兩個組成分(方差貢獻率63.62%)的得分做向量圖，結果如圖3 所示。

圖4 主成分分析結果Fig.4 Results of principal component analysis

由圖4 可知，11 批飲片相對集中地分散于3 個部分，S4、S6、S7、S9 集中于a 部分，S1、S2、S3、S5、S8、S10 集中于b 部分，S11 遠離其它批次集中于c部分。a、b、c 之間相對偏離較大，表明彼此之間成分差異性較大，該分析結果與聚類分析結果具有一致性。其中，a 部分4 個點分布較為離散，表明對應4 個批次的飲片間存在著一定的差異性;b 部分又可以相對地分為兩部分:S10 與S1 極為接近，表明對應的飲片具有顯著地相似性，S2、S3、S5、S8 同樣具有一定的相似性，表明S10 與S1 之間，S2、S3 與S5、S8 飲片之間成分較為接近，但是每一點之間又相對離散，說明各飲片之間存在一定的差異性;S11 因哈巴苷與哈巴俄苷總含量較高而單獨歸為一類。可知，主成分分析在一定程度上反映了玄參飲片之間存在的統一性及差異性，與聚類分析吻合性較好。

3 結論

重慶市售16 批玄參飲片中只有11 批飲含量符合2010 年版《中國藥典》規定，合格率僅為68.75%，說明目前藥材市場上玄參飲片質量參差不齊。筆者經過文獻調研發現影響玄參質量的因素有很多，歸納起來主要有:玄參藥材生產過程中缺少質量管理規范，不能從源頭上控制中藥飲片質量，導致藥材不能達到“真實、優質、穩定、可控”的標準;中藥材市場經營缺乏規范化管理，一些不法商販為牟取暴利以假摻雜或以次充好;玄參成分復雜，成分相互之間會發生很多化學反應，外界條件稍有變化，即可能造成其成分存在明顯差異;玄參系大宗藥材，經常與其他藥材混合存儲，儲存條件落后且重慶地區多高溫高濕天氣，易于產生蟲害和霉變而影響藥材質量。以上種種皆可歸根于生產缺少規范化標準，如飲片在炮制中可能存在炮制不規范、質量標準不統一等問題，筆者呼吁相關部門加大對玄參飲片炮制、質量檢驗地規范化管理。

一測多評法作為一種全新的多指標質量評價模式，實現了在對照品缺失的情況下，完成多指標成分定量，達到真正對中藥內在質量進行有效表征、綜合評價和全面控制的目的，對于中藥的質量控制和評價模式具有重要作用。本研究在一測多評測定玄參飲片多指標成分含量的基礎上，建立了玄參飲片的指紋圖譜，并結合聚類分析、主成分分析方法對玄參的質量進行綜合全面地評價，為玄參飲片質量的控制和評價提供更好的技術參考，為玄參飲片質量標準的提高研究提供了科學依據。

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