藏藥菥蓂中黑芥子苷對黃嘌呤致小鼠高尿酸作用的研究

柯秀梅，楊榮平，王云紅，劉 楠，周文杰，張小梅*

1 成都中醫藥大學藥學院，成都 611137;2 重慶市中藥研究院重慶市中藥資源重點實驗室，重慶 400065

痛風是由于嘌呤代謝紊亂，產生尿酸過多和(或)尿酸排泄減少，血尿酸濃度持續增高所致的一組疾病［1］，高尿酸血癥為其特征性表現之一。隨著人們生活水平的提高及飲食結構的改變，痛風發病率已日益增加［2］。有調查結果表明，我國痛風患者占總人口的1%～2%［3］，有人預計21 世紀痛風患者在我國將成為僅次于糖尿病的代謝病［4］。現代醫學對痛風的治療已取得較大進展，但短期療效顯著，長期效果不理想，且副作用大。傳統醫藥獨特的辯證體系在治療、緩解本病病情方面具一定優勢。

菥蓂為雙子葉植物十字花科菥蓂Thlaspi arvense L.的干燥地上部分，又叫遏藍菜、蘇敗醬(江蘇)、南敗醬(湖北)、苦芥子等，分布全國各地［5］，為藥食兩用的藏藥。其嫩苗、全草、種子皆可入藥，嫩苗和中益氣、利肝明目;全草具有清熱解毒、消腫排膿［6］的功效，主治目赤腫痛、淚出、脘腹脹痛，脅痛，腸癰，水腫，帶下，瘡癤癰腫，常用于治療腎炎、子宮內膜炎［7］。在西藏民間常用來治療痛風，效果甚好。菥蓂全草含有黑芥子苷、芥子酶、吲哚類［8］、揮發油［9］和黃酮類［10］等成分。文獻報道，黑芥子苷能促進尿酸排泄，有效治療痛風［11］。課題組前期將菥蓂用于治療痛風并對其進行系統研究，在此基礎上，本文研究提取液中黑芥子苷的含量與其降低黃嘌呤致小鼠高尿酸模型尿酸程度作用的關系。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

藥材購于重慶儲奇門藥材市場，經重慶市中藥研究院生藥所秦松云副研究員鑒定為十字花科菥蓂植物的干燥地上部位;別嘌醇片(重慶青陽藥業有限公司產品，批號為110301);黃嘌呤(美國SIGMA公司，批號為20100613);黑芥子苷對照品(美國SIGMA 公司，批號為101016464，含量≥99.0%);尿酸(中國醫藥集團上海化學試劑進口分裝，批號為0001211);水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑皆為分析純。

Waters 2695 高效液相色譜儀，Waters 2996 DAD檢測器，Waters Empower 工作站;電熱恒溫鼓風干燥箱(鞏義市予華儀器責任有限公司);FE20 型實驗室pH 計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);電子天平(千分之一，上海精密科學儀器有限公司);電子天平(萬分之一，十萬分之一，德國賽多利斯科學儀器北京有限公司)。

1.2 研究對象

7 周齡雄性SPF 級昆明小鼠，體重18～22 g，由重慶市中藥研究院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(渝)2012-0007。

1.3 研究方法

1.3.1 提取液的制備

①滅活(MHSTY)菥蓂水提液的制備:稱取經烘箱120 ℃滅活40 min 的菥蓂藥材粗粉100 g，加水1L 回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至100 mL，即得含生藥材1 g/mL 的水提液;②未滅活(WMHSTY)菥蓂水提液的制備:稱取菥蓂藥材粗粉100 g，加水1 L 回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至100 mL，即得含生藥材1 g/mL 的水提液;③菥蓂醇提液(CTY)的制備:稱取菥蓂藥材粗粉100 g，加乙醇1 L 回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇至無醇味，加水稀釋至100 mL，即得含生藥材1 g/mL 的醇提液;④菥蓂水提醇沉濃縮液(STCCNSY)的制備:稱取菥蓂藥材粗粉300 g，按“①”方法制備菥蓂水提液300 mL，加乙醇至含醇量為50%進行醇沉，靜置冷藏24 h，回收乙醇并濃縮至100 mL，即得含生藥材3 g/mL 的濃縮液。分別取上述提取液1.0 mL，加水5.0 mL 稀釋，濾過，取續濾液10 μL 進樣，供HPLC 分析。

1.3.2 黑芥子苷HPLC 分析方法的建立

1.3.2.1 HPLC 條件

Boston ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:0.02 M C16H37NO4S 水溶液(用1.3 M氫氧化鈉和0.4 M 磷酸二氫鈉水溶液調pH=7)-乙腈(85∶15);柱溫25 ℃，檢測波長225 nm，流速1 mL/min。

1.3.2.2 線性關系考察

精密稱取經五氧化二磷減壓干燥24 h 的黑芥子苷對照品10.50 mg 置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含0.42 mg 黑芥子苷的儲備液。精密吸取適量儲備液以甲醇配制成不同濃度(0.021、0.084、0.168、0.336 mg/mL)的對照品溶液，按“1.3.2.1”項下方法進樣分析。以峰面積(Y)對濃度(X)進行回歸，回歸方程為Y=9.82×106X+1.84×104(r=0.99995)。結果表明黑芥子苷在0.021～0.42 mg/mL 內色譜峰面積與濃度的線性關系良好。

1.3.2.3 精密度試驗

精密吸取黑芥子苷對照品溶液連續進樣6 次，每次進樣10 μL，按“1.3.2.1”項下方法測定，并計算6 次峰面積的RSD%為1.02%，表明儀器精密度良好。

1.3.2.4 重現性試驗

取藥材粗粉100 g，按“1.3.1①”項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按“1.3.2.1”項下方法測定各樣品中黑芥子苷含量，并計算RSD 值為1.68%，表明本方法重現性好。

1.3.2.5 加樣回收率試驗

稱取藥材粗粉50 g，加入黑芥子苷對照品18.25 mg，按“1.3.1①”項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按“1.3.2.1”項下方法測定各供試品溶液中黑芥子苷含量，并計算平均回收率為99.12%，RSD 值為2.38%。

1.3.3 動物分組與給藥

昆明小鼠隨機分為7 組:模型組、空白對照組、陽性組、未滅活水提液(WMHSTY)組、滅活水提液(MHSTY)組、醇提液(CTY)組和水提醇沉濃縮液(STCCNSY)組。每組灌服相應藥物，給藥劑量為5.0 g/kg，陽性對照組給予別嘌醇片0.12 g/kg，模型組與對照組給予等量蒸餾水。各組均灌胃給藥5 d，每日1 次，第5 d 給藥后造模:除正常對照組外，各組均腹腔注射黃嘌呤懸液0.02 mL/g，1 h 后摘眼球法取血，3000 rpm 離心，檢測血清中尿酸含量。

1.3.4 數據分析

2 實驗結果

2.1 黑芥子苷含測結果

HPLC 色譜圖見圖1，含測結果(表1)表明，菥蓂醇提液中黑芥子苷的含量最高，其次為滅活水提液，濃縮液中未檢測出黑芥子苷。

Fig.1 HPLC chromatograms of standard(A)，CTY(B)and STCCNSY(C)

表1 藏藥菥蓂提取液中黑芥子苷的含量Table 1 Content of sinigrin in different extracts of T.awogrlse

2.2 MHSTY 與WMHSTY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響

表2 MHSTY 與WMHSTY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型尿酸的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of MHSTY and WMHSTY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

表2 MHSTY 與WMHSTY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型尿酸的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of MHSTY and WMHSTY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

注:與模型組相比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

結果見表2，與對照組比，模型組尿酸值顯著升高，表明造模成功。與模型組比，MHSTY 和WMHSTY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型均有顯著降低尿酸作用，其中MHSTY 有極顯著降低尿酸作用。

2.3 WMHSTY 和CTY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響

結果見表3，與對照組比，模型組尿酸值顯著升高，表明造模成功。與模型組比，CTY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型無明顯影響，WMHSTY 對該模型有顯著降低尿酸作用，表明菥蓂治療痛風的有效作用部位在水提液部位。

表3 WMHSTY 和CTY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of WMHSTY and CTY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

表3 WMHSTY 和CTY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of WMHSTY and CTY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

注:與模型組相比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

2.4 STCCNSY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響

結果見表4，與對照組比，模型組尿酸值顯著升高，表明造模成功。與模型組比，STNSY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型有極顯著降低尿酸作用。

表4 STCCNSY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of STNCCNSY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

表4 STCCNSY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of STNCCNSY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

注:與模型組相比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

2.5 黑芥子苷含量與菥蓂對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型作用的關系

圖2 表明，藏藥菥蓂提取液中，CTY 中黑芥子苷含量最高，其次為WMHSTY，STCCNSY 中HPLC 法無法檢測出黑芥子苷;MHSTY 和STCCNSY 對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型有極顯著降低尿酸作用，WMHSTY 對本模型有顯著作用，而CTY 對該模型無明顯作用。表明藏藥菥蓂中黑芥子苷與其對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型作用無明顯關系，其物質基礎有待進一步研究。

圖2 藏藥菥蓂中黑芥子苷含量與菥蓂對黃嘌呤致小鼠高尿酸模型作用的關系Fig.2 The relationship between sinigrin content in different extracts of T.awogrlse and their effects on high uric levels

3 結論

本試驗中水提醇沉濃縮液中無法檢測出黑芥子苷成分，預實驗表明黑芥子苷對熱不穩定。黑芥子苷是一種硫苷，它既能溶于水，又能溶于乙醇或含水醇，在常溫、干燥條件下相對穩定，但在濕熱條件下，易發生有酶(芥子酶)降解與無酶降解，其降解速率與溫度和體系含水量有關，溫度越高，含水量越高，降解越快。含有苷類等次生代謝產物的天然藥物細胞內一般同時含有能分解苷類成分的酶，如黃芩苷、龍膽苦苷等。由于溫濕度對黑芥子苷的穩定性有一定影響，故本實驗采用了鼓風加熱的方式迅速殺酶，而不是傳統的蒸、清炒、燀等方法。預試驗以黑芥子苷含量為指標，采用單因素試驗法對藏藥菥蓂藥材滅活工藝主要影響因素滅活溫度(110、120 和130℃)和滅活時間(20、40 min 和60 min)進行了考察，優選出120 ℃下鼓風加熱40 min 的滅活條件。

菥蓂經水提后收膏率約16%，就單味藥而言，出膏率過高，不利于制劑成型工藝研究。水提醇沉法是較傳統的一種除雜方法，其基本原理是根據物質溶解度差別進行分離，使一部分物質沉淀析出。具有操作簡便，乙醇沸點適中，回收乙醇可重復使用的特點，能降低成本。本實驗以黑芥子苷為含測指標，結合藥效試驗結果，采用單因素試驗對菥蓂水提醇沉工藝主要影響因素乙醇含量(30%、50% 和70%)、藥液濃度(以生藥量計，0.5、1.0 g/mL 和2.0 g/mL)和醇沉時間(6、12 h 和24 h)進行了系統考察，優選出1.0 g/mL 藥液濃度加乙醇至含醇量為50%，醇沉24 h 的醇沉工藝條件。

菥蓂為藥食兩用的藏藥，西藏民間常用來治療痛風。目前對藏藥菥蓂的現代藥理學研究較少，未見文獻報道，其治療痛風的物質基礎不清楚。據報道，黑芥子苷能有效治療痛風［12-14］。本文采用化學與藥效評價相結合的試驗方法，對藏藥菥蓂中黑芥子苷與菥蓂治療痛風的關系進行研究。結果表明，藏藥菥蓂治療痛風作用與其中所含的黑芥子苷無明顯作用關系，其物質基礎有待進一步研究。

課題組旨在研究菥蓂治療痛風的作用及其物質基礎，主要藥效學研究通常需采用兩種及兩種以上的試驗方法來互相佐證，而本文僅采用了黃嘌呤致小鼠高尿酸這一模型對其進行研究，不足以斷定菥蓂對痛風的作用。作者將采用尿酸鈉(MSU)誘導的關節炎模型進行進一步驗證菥蓂中黑芥子苷與菥蓂治療痛風的關系。

1 Mu YH，Yin HB，Shi B.To explore the prevention and cure of hyperuricemia and gout from the traditional Chinese medicine“preventive treatment of disease”.Beijing J TCM，2013，32:44-46.

2 Huang QM，Chen JC.The study progress of traditional Chinese medicine pathogenesis and treatment on treating gouty arthritis.Rheumatism Arthritis，20132:57-63.

3 Zhang LS，Liu XL.Modern Pain Science.Shijiazhuang:Hebei Science and Technology Press，2002.948.

4 Kuang HT.Research overview of Chinese medicine treatment on gout.Hunan J TCM，2005，21(2):79-80.

5 Chen Y，Zhou H，Wu LP，et al.HPLC determines sinigrin in seed of Thlaspi awogrlse L.West China J Pharm Sci，2012，27:94-95.

6 Wang LL，Chen C，Zhou H，et al.Determination of sinigrin in semen Thlaspi from Sichuan and Tibet using near infrared diffuse reflectance spectroscopy.Spectrosco Spectr Anal，2009，29:2673-2676.

7 Tu J，Zhang XS，Luo X，et al.Study on the chemical constituents of the essential oil in Thlaspi arvense L.Chem Res Appl，2006，18:1340-1342.

8 Pang S，Wang LS，Shi X，et al.Isolation and purification of isovitexin and HPLC fingerprint of Thlaspi arvense Linn.Guangdong Agric Sci，2012，1:105-106.

9 Editorial Committee of Chinese Academy of Sciences Flora ofChina，Flora of China.Beijing:Science Press，1999.79-84.

10 Zhang ZZ.Biological characteristics and processing of edible Thlaspi awogrlse L.Spec Econ Animal Plant，2005，5:25.

11 Wang ZS，Xue H.Shennong’s Classic of Materia Medica.Chengdu:Sichuan Science and Technology Press，2008.06.